$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroskop Kurulumu ve Zaman Geçişi Kaydı
NOT: Burada tarif edilen protokol, otonetlemeli ters geniş alan mikroskobu, 100X/1.30 NA yağ PH3 objektefi, X, Y motorlu aşama, sCMOS kamera, ışık kaynağı, yeşil-floresan, kırmızı-floresan veya sarı-floresan proteinler için filtreler ve sıcaklık kontrollü kuluçka odası için geliştirilmiştir. Bu oda, hücreleri ışıktan koruyor ve sabit sıcaklıkta tutar.
- Mikroskopiye başlamadan önce inkubasyon odasını ve mikroskobu ~1 - 2 saat boyunca 32 °C'ye kadar ısıtın.
NOT: Mikroskop kurulumuna bağlı olarak, ısıtma daha uzun sürebilir. Ön ısıtma, kaymayı azaltmak ve otomatik odaklama kontrol sistemini stabilize etmek için gereklidir. - Mikroskobu açın ve mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Faz kontrastı görüntüleri ile yeşil-floresan, kırmızı-floresan veya sarı-floresan proteinlerin görüntülerini elde etmek için doğru adı, doğru aynalar ve filtreleri seçin.
NOT: Bir mikroskop genellikle mikroskop kontrolü ve görüntü alımı için tercih edilen yazılımlarla birlikte sunulur. Burada, ticari olarak kullanılabilir bir yazılım (bkz. Materyaller Tablosu) mikroskop ve görüntü alımı kontrol etmek için kullanıldı. - Objektif merceğe ve numunenin altına 32 °C'de önceden inkubasyon edilmiş bir damla yüksek kaliteli daldırma yağı ekleyin. Numune mikroskop aşamasına konduğunda zarar görmemek için objektif en düşük Z-konumuna yerleştirilin. Numuneyle birlikte metal çerçeveyi mikroskop aşamasına yerleştirin, "delik tarafı" objektîfe doğru olsun. Örneği sahne tutucusuna sıkıca sabitleyin.
- Sahneyi Z yönünde hedefe daha yakın hareket ettirerek hücrelere odaklanın. Yağ numunenin alt tarafına düştüğünde ve objektif lens temas ettiğinde aşamayı yavaşça hareket ettirin. Sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin, ta ki hücreler odak düzlemindeyken görüş bölgesinde birden fazla tek hücre görünür hale gelsin. Alınan görüntüleri daha sonra hizalayabilmek için en az bir floresan mikrosferin görüş bölgesinde olduğundan emin olun.
NOT: Optimal koşullarda, görüş bölgesi başına 15 - 30 hücre yoğunluğuna (2.048 x 2.048 piksel veya 133,1 x 133,1 μm) ulaşılmalıdır. - Mikroskop kontrol yazılımının Çok Boyutlu Alım sihirbazını açın; böylece mikroskobun birden fazla dalga boyunda ve sahne konumunda görüntü almasını sağlayan bir zaman geçişli deneyi kurabilirsiniz.
- Ana sekmede, Timelapse ve Çoklu Dalga Boyları aktive edin. Pencerenin sol tarafında ek sekmeler belirecek.
- Kaydetme sekmesine tıklayın ve Dizini Seçerek bilgisayarın sabit diskinde boş bir klasör seçerek elde edilen görüntüleri kaydedin. Dosya varsa Artırım taban adını etkinleştirin ki ardışık veri setleri öncekilerin üzerine yazmasın. Sonra deneye tarih ve suş adı veya deneyin başlığı ile bir isim verin.
- Zaman geçişi parametrelerini ayarlamak için Time-lapse sekmesine tıklayın. Süreyi 24 saate, Zaman Aralığını ise 20 dakikaya ayarlayın. Zaman Sayısı otomatik olarak değişir.
NOT: Optimal zaman aralığı, deneye ve analiz edilecek hücresel fonksiyona bağlıdır. Sık sık yapılan görüntü alımları foto ağartmaya neden olabilir. Bu nedenle, zamansal çözünürlük ile foto ağartma arasında ampirik olarak bir denge bulunmalıdır. 4 - 6 saat ikiqatlama süresinde, faz kontrast mikroskopisi için 5 dakika (veya istenirse daha kısa aralıklarla) kolayca görüntüler alınabilir. 24 saatlik bir süre boyunca floresans mikroskopisi isteniyorsa, görüntüler yaklaşık 15 - 30 dakika aralıklı olarak kaydedilmelidir. - Wavelengths sekmesine tıklayın. Her zaman noktasında her görüntü için alınacak dalga boyları sayısını değiştirerek seçin.
NOT: Her dalga boyu için, Çok Boyutlu Edinme büyücüsünün sol tarafında yeni bir sekme belirir ve dalga boyları yukarıdan aşağıya sırayla alınır. Her dalga boyu için alım ayarları ayrı ayrı değiştirilebilir. - Üstten ilk dalga boyu sekmesine tıklayın. Aydınlatma açılır menüsünden Faz kontrastını seçin. Pozlama için 100 ms seçin ve Acquire açılır menüsünden Her Zaman Noktası'nı seçin. Otomatik Pozlama'yı devre dışı bırakın, açılır menüden Hiç Zaman seçeneğini seçin.
- Her zaman noktasında elde edilmesi gereken her dalga boyu için 3.5.5 adımını tekrarlayın. Burada tanımlanan deneysel kurulum ve floresan etiketli proteinler için, Maruziyet için aşağıdaki parametreleri kullanın: mKiraz füzyon proteinleri için 250 ms, YFP (Sarı floresan protein) füzyon proteinleri için 200 ms ve GFP (Yeşil floresan protein) füzyon proteinleri için 1.000 ms.
NOT: Her suş ve floresan protein için optimal aydınlatma ayarları, her dalga boyu için lamba yoğunluğu ve görüntü alma süresi değiştirilerek önceden belirlenmelidir. Çok uzun görüntü alma süreleri fototoksik etkiyi artırır ve nihayetinde büyüme durması ve hücre ölümüne yol açar. Bu nedenle, görüntü kalitesi ile hücre yaşamlılığı arasında bir denge sağlanmalıdır. - Aynı deneyde kaydedilen hücre sayısını artırmak için birden fazla aşama konumundan görüntüler alın.
- Birden fazla sahne konumundan görüntü almak için Ana sekmede Çoklu Sahne Pozisyonları'nı etkinleştirin. Sonra Sahne sekmesine tıklayın ve Canlı butonuna tıklayarak görüş alanına bakın.
- Sahneyi X/Y yönünde hareket ettirin, ta ki ilgi alanı (ROI) görüş alanına gire. Sahne sekmesinde "+" tuşuna tıklayarak X- ve Y koordinatlarını kaydedebilirsiniz. Aşamayı tekrar X/Y yönünde hareket ettirin ve yeni bir yatırım getirisi bulunana kadar ve koordinatları tekrar kaydederek "+" tuşuna tıklayın. İstenilen bölge sayısı kaydedilene kadar devam edin.
NOT: Floresans görüntü alımında, ilgi çekici bölgelerin (ROI) birbirine çok yakın olmamasına dikkat edin ki fototoksisiteyi en aza indirin.
- Hücrelerin odakta olup olmadığını bir kez daha kontrol etmek için farklı kaydedilen X ve Y pozisyonlarına tıklayın ve deney boyunca kaydedilen Z-konumunun sabit kalması için AFC basılı tuşuna tıklayarak donanım otomatik odaklamasını başlatın.
- Multi-Dimensional Acquisition sihirbazında Edin'e tıklayarak mikroskop kontrol yazılımında zaman geçişi kayıtlarını başlatın.
NOT: Elde edilen her dalga boyu için bir pencere belirir, ayrıca elde edilen zaman noktaları sayısını ve bir sonraki fotoğraf alımına kadar olan zamanı gösteren ek bir pencere belirir. - Zaman geçişli kayıtlarda ilk birkaç zaman noktasından sonra hücrelerin hâlâ odakta olduğundan emin olun ve görüntü kalitesini en üst düzeye çıkarmak için yeniden odaklayın.