E. coli üzerinde Bdellovibrio bacteriovorus avlanmasının Canlı Hücre Zaman Geçişli Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Makowski, Ł. ve diğerleri. Bakteriyel Avcı Bdellovibrio bacteriovorus'un yaşam döngüsünün Zaman Geçişli Flüoresans Mikroskopisi kullanılarak canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, Bdellovibrio bacteriovorus'un immobilize edilmiş E. coli'yi agaroz pedinin altında avladığı zaman geçişli floresan görüntülemeyi göstererek, bakteriyel predasyon ve konak-patojen etkileşimlerini incelemek için hücre içi çoğaltma ve soyut salınımının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlıyor.

Protokol

1. Zaman geçişli floresan mikroskopinin iletimleri

1. 35 mm'lik çanağı deney sırasında hareket etmeyecek şekilde Petri kabı tutucusuna yerleştirin. 35 mm çanağın altına ve objektîfe bir damla daldırma yağı (1.518 kırılma indeksi) koyun.
2. Tutucuyu mikroskop odasındaki ters mikroskobun aşamasına monte edin.
3. Mikroskop kontrol yazılımında seçenekleri, zamanla birden fazla aşama pozisyonunda birden fazla görüntü toplamak için ayarlayın.
   1. Büyütmeyi (100x) ve polikromik merceği (GFP (yeşil floresan protein)/mCherry) ayarlayın. Okulluk ve parlak alan (BF) kullanarak odak düzlemini bulun ve puan listesi yöneticisini açın.
   2. Aşamayı hareket ettirerek ve her konumun koordinatlarını mikroskop yazılımında Mark noktası düğmesine tıklayarak en az 10 ilgi çekici pozisyon seçin. Foto ağartmayı ve fototoksisiteyi önlemek için birbirine yakın konumlardan kaçının. Kamera valfini okuldan monitöre çevirin ve odak düzlemini ayarlayıp puan listesi yöneticisinde Noktayı Değiştir butonuna tıklayarak her noktayı kalibre edin.
   3. Deney tasarımcısını açın ve her sekmedeki tüm deneysel parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
      1. Z-stacking kutusunu işaretten çıkarın.
      2. Floresan kanalları seçin ve optimal aydınlatma ayarlarını ayarlayın. Burada şu ayarlar kullanıldı: mCherry kanalı için mCherry filtre setleri (EX575/25; EM625/45), %50 yoğunluk ve 200 ms pozlama süresi; GFP kanalı için GFP filtre seti (EX475/28; EM525/48), %50 yoğunluk ve 80 ms; BF görüntüleri için ise POL kanalı, %5 yoğunluk ve 50 ms.
      3. Görüntü alınma ile deneyin toplam süresi arasındaki aralıkları seçin. Burada, deneyin 10 saatlik süresi boyunca 5 dakikalık aralıklar uygulandı.
      4. Seçilen pozisyonlar için odak korumasını etkinleştirin (burada kullanılan sistem için, UltimateFocus işaret kutusu ile Focus Koruy'u işaretleyerek).
      5. Görsel dosyalarının otomatik olarak kaydedilmesi gereken veri klasörünü seçin.
      6. Mikroskop yazılım kontrolündeki tüm ayarları tekrar kontrol edin, ardından zaman geçişi deneyini başlatın.
4. Deneyin ilk saatinden sonra, tüm sahne pozisyonlarının hâlâ odakta olduğundan emin olun. Gerekirse görüntü alımları arasındaki zaman aralıklarında odaklığı ayarlayın.
5. Zaman geçişi deneyi tamamlandığında, Petri kabını çıkarın ve biyolojik güvenlik protokolüne göre 35 mm kabı agaroz pediyle kullanın.
   NOT: 1.2. adımdan sonraki tüm alt adımlar DeltaVision Elite kullanıcılarına özgüdür. Diğer sistemler kullanan araştırmacılar, ayarları bireysel sistemlere göre ayarlamak zorundadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sertifikalı Moleküler Biyoloji Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agaroz pedi için düşük floresanslı agaroz
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Açık kaynak görüntü işleme paketi
Cam Taban Çanak 35 mm	ibidi	81218-200	Kaplamasız cam
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, nihai odaklama lazer modülü, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI montajı FP DV, kit obj. Oly 100x yağ 1.4 NA, prizma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
SoftWoRx'i başlat	GE		Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı