Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Abstract

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Protocol

1. Görüntüleme

1. Kapatılmış slaytı mikroskopa yerleştirin ve ortamla sıcaklığı dengelemek için 5 dakika bekletin. Mikroskop odası, numune hazırlama odasından farklı bir sıcaklıkta olabilir.
2. Numunenin floresan bir z-yığını alın.
   NOT: Z-yığını, alan derinliğinden daha az z-aralıkla örneği tamamen kaplamalıdır. 1.45 NA 100x objektif ve ~1 μm kalınlığında E. coli hücreleri için, her adım başına 100 nm hızda 40 adım iyi çalışır. Daha büyük hücreler veya yüzeyde tamamen düz olmayan hücreler için 50 veya daha fazla adım gerekebilir. Yeterli adımı ekleyin ve örneğin üstü ve alt kısmı tamamen bulanık olduğundan emin olun.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Pamuk çubuk	Puritan Tıbbi Ürünler Şirketi LLC	S304659	VaLaP uygulamak için kullanıldı
Kapak slipleri	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	Kro hücreleri için kullanılıyor
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Parafin ve vazelin ile birleştirerek VaLaP elde edin
LB büyüme ortamı	BD Difco	DF0446173
M63 orta	ABD Biyoloji	M1015
MATLAB	Mathworks		İleri konvolüsiyon betiklerini çalıştırmak için gerekli
Mikroskop slaytları	Fisher	12-550-133
NIS unsurları	Nkon
Parafin	Sigma-Aldrich	327212
Vazelin	Eşit	49035-038-27
Piezo z aşaması	Nikon	77011589
Pipet uçları -p200	USA Scientific	1111-0730
Pipet uçları- s10	USA Scientific	1111-3730