Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Görüntüleme

1. Kapatılmış slaytı mikroskopa yerleştirin ve ortamla sıcaklığı dengelemek için 5 dakika bekletin. Mikroskop odası, numune hazırlama odasından farklı bir sıcaklıkta olabilir.
2. Numunenin floresan bir z-yığını alın.
   NOT: Z-yığını, alan derinliğinden daha az z-aralıkla örneği tamamen kaplamalıdır. 1.45 NA 100x objektif ve ~1 μm kalınlığında E. coli hücreleri için, her adım başına 100 nm hızda 40 adım iyi çalışır. Daha büyük hücreler veya yüzeyde tamamen düz olmayan hücreler için 50 veya daha fazla adım gerekebilir. Yeterli adımı ekleyin ve örneğin üstü ve alt kısmı tamamen bulanık olduğundan emin olun.
   1. Mikroskopu kontrol etmek için mikroskopla ilişkili yazılımı ( bkz. Malzemeler Tablosu) kullanın.
   2. Mikroskop odak tekerlekleriyle hücrenin ortasına odaklanın. ND ediniminde Z kutusunu işaretleyin ve bir z-stack alın. Ana sayfa düğmesine tıklayarak hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak belirleyin. Step boyutunu 0.1 μm olarak ayarlayın ve Aralığı 4 μm olarak ayarlayın. Z cihazının piezo aşamasına ayarlandığından emin olun.
   3. Lambda Penceresi'nin altındaki floresan kanalları, görüntülenen floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın. Bu deneyde GFP ve mCherry kullanıldı.
      NOT: Eğer ek bir floresan kanalın 3D dağılımı isteniyorsa, ikinci renk kanalında aynı Adım Boyutu ve Aralığına sahip ek bir z-yığını alın. Bu deneyde, hücre şeklini belirlemek için sitoplazmik mCherry kullanıldı ve MreB-GFP ikinci renk kanalı olarak kullanıldı.
   4. Deney Sırası'nın lambda (z serisi) olarak ayarlandığından emin olun, böylece geçiş öncesi her renk kanalında tam bir z-yığını alınır.
   5. Görüntü alımını başlatmak için Çalıştır Now'a tıklayın ve bir veya iki z-stack tamamlandığında dosyayı kaydet.
   6. Pad'de yeni bir alana geçin ve 1.2.2-1.2.5 adımlarını tekrarlayın.

2. Hücre Yeniden Yapılandırması

1. Bireysel hücreleri kırpın ve görüntüleri üst üste yığılmış bir tiff dosyası olarak kaydedin ki dosya başına sadece bir hücre olsun. Bu hücrenin diğer hücrelerden iyi izole olduğundan emin olun (yani, xy cinsindeki bulanıklaştırma fonksiyonunun tam genişlikteki yarı maksimumunun yaklaşık 5 katı kadar).
   NOT: Bu, ücretsiz erişilebilir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir ( bkz. Materyaller Tablosu).
   1. Bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve o hücreyi her kanal için bir kez 2 kez çoğaltın. Duplicate hyperstack kutusunun işaretli olduğundan emin olun ve kanalı ya 1 ya da 2'ye değiştirin, böylece dilimlerin tüm z-stack'i içerdiğinden emin olun.
      NOT: Sadece hücrelerin şekli görüntülenirse ve ek bir floresan protein değil, sadece bir kanal olur.
   2. Her iki yığın da kullanılabilir olduğunda, Resimler | Yığınlar | Araçlar | Önce protein kanalı, sonra şekil kanalı ile görüntüleri birleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Pamuk çubuk	Puritan Tıbbi Ürünler Şirketi LLC	S304659	VaLaP uygulamak için kullanıldı
Kapak slipleri	VWR	16004-302
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc	Kro hücreleri için kullanılıyor
Lanolin	Sigma-Aldrich	L7387	Parafin ve vazelin ile birleştirerek VaLaP elde edin
LB büyüme ortamı	BD Difco	DF0446173
M63 orta	ABD Biyoloji	M1015
MATLAB	Mathworks		İleri konvolüsiyon betiklerini çalıştırmak için gerekli
Mikroskop slaytları	Fisher	12-550-133
NIS unsurları	Nkon
Parafin	Sigma-Aldrich	327212
Vazelin	Eşit	49035-038-27
Piezo z aşaması	Nikon	77011589
Pipet uçları -p200	USA Scientific	1111-0730
Pipet uçları- s10	USA Scientific	1111-3730