$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bağırsak kolonizasyon seviyelerinin belirlenmesi
NOT: Bağırsak kolonizasyonu, zebrafish modelinde en faydalı metriktir; çünkü çeşitli V. cholerae suşlarının göreceli uygunluğunu veya mutasyonların ya da gen nakavtlarının etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir.
1. Ötenazi
1. Deney istenen son noktaya ulaştığında, enfeksiyon suyundan bir numune alın (genellikle 15 mL yeterlidir) böylece dışarı atılan bakteri sayımları ve istenilirse ishal ölçümü (örneğin müsin testi, protein içeriği ve/veya OD) yapılabilir.
2. Kalan suyu balık ağından (balıkları toplamak için) çamaşır suyu ile dökerek V. cholerae'yi suda öldürür.
3. Balığı enfeksiyon suyu ile 336 μg/mL Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (tricaine) içeren bir beğene koyup balığı bu trikain çözeltisinde RT süresinde 20 dakika kuluçka yapın.
NOT: Balık filesi %10 çamaşır suyu çözeltisi ile sterilize edildi.
2. Diseksiyon
1. Balığın hazırlanması
1. Trikain çözeltisinden bir balığı tek kullanımlık plastik kaşıkla alıp diseksiyon yüzeyine yerleştirin.
2. Balığı ventral tarafı yukarıya bakacak şekilde konumlandırın ve alt çenesinden geçirin, pimin küt ucu vücudun merkezinden uzakta açılı olarak yerleştirilsin. Anüsün hemen arkasına bir pim daha yerleştirin, o da vücuttan uzakta açılı olarak.
2. Bağırsak yolunun açığa çıkması
1. Balığın ventral yüzeyini tüy içermeyen bir mendil ile %70 etanole batırarak temizleyin.
2. Bir neşteri ve Vannas makaslarını %70 etanole batırıp alevle kısırlaştırın.
3. Pulları delip skarpel kullanarak karnında derinin hemen altında uzununa küçük bir kesi yapın. Bağırsak sistemi derinin hemen altında yer aldığı için çok derin kesmemeye dikkat edin.
4. Makasla kesiyi vücut boyunca dikkatlice uzatın, cilt seviyesinden derin kesin ve anüsün önüne geçin.
5. Kesiyi açmak için makasla balığın başına doğru iki yan kesik yapın.
6. Yan kesiklerin her iki tarafındaki deriyi disseksiyon yüzeyine sabitleyin, iğneleri vücuttan uzaklaştırarak dışarı doğru eğin.
NOT: Pimlerin uçları daha önce alkolle ateşlenerek sterilize ediliyordu.
3. Bağırsak yolunun alınması
NOT: Bağırsak yolu, diğer organların üstünde soluk ve çok ince bir tüp olarak görünür olmalıdır.
1. Pensepsleri alevle sterilize edin ve ardından tüm bağırsak traktını (genellikle 12–15 mm uzunluğunda) çıkarmak için kullanın. Bağırsağı, cam boncuklar (bkz. 1.3.1–1.3.2) ve 1 mL 1x PBS veya LB içeren bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin; buzun üzerinde.
3. Homojenleşme
1. Homojenizasyon tüplerini önceden hazırlayın; ~1,5 g 1 mm cam boncukları 2 mL'lik vida kapaklı tüplere dökün (yaklaşık yarısına kadar doldurun) ve ardından otoklavlama ile sterilize edin.
2. 1 ml steril LB veya 1x PBS ekleyin.
3. Zebrafish bağırsakları tüplere eklendikten sonra ( adım 1.2.3.1), kapakları çok sıkı vidalın ve ardından tüpleri vortex homojenizatoruna sabitleyin.
4. Örnekleri maksimum ayarda 1 dakika homojenleştirin, ardından 1–2 dakika buzda soğutun. Tam homojenleşme için bu homojenleşme döngüsünü bir kez daha tekrarlayın. Not: Homojenleştirme için birkaç alternatif yöntem de işe yarar.
4. Bağırsak kolonizasyon seviyelerinin nicelendirilmesi
1. Her tüpeye 900 μL LB veya 1x PBS ekleyerek homojenatın seri seyreltilmesi için tüpler (küçük cam test tüpleri veya 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri) hazırlanır. Her balık için, 5–6 tüp hazırlayın ve bağırsak homojenatını 10 kat seri seyreltme yaparak birinci tüpe 100 μL homojenat ekleyerek, onu karıştırmak için vortex ile yaparak ve ardından birinci tüpten ikinci tüpe 100 μL ekleyerek yapın.
2. Tüm seyreltmeler hazırlanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
3. LB agar plakalarında her seyreltmeden 100–200 μL levha (Streptomycin dirençli suşlar kullanılıyorsa) 100 μg/mL streptomisin ve 40 μg/mL X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid) içeren levha. Plakaları 30 °C'de 16–18 saat boyunca kuluçka edin.
4. Gece kuluçkasından sonra, V. cholerae kolonilerini plakalarda sayın; ya otomatik bir koloni sayacı kullanarak ya da kolonileri manuel olarak sayarak; Sayılan kolonileri işaretleme ucu ile işaretlemek faydalıdır.
5. Plaka sayısını, süspansiyonun seyrelme faktörüyle çarparak balık bağırsağına başına CFU'yu belirleyin; bu hacmi dikkate alarak alın.