Yetişkin Zebrabalıklarda Vibrio cholerae ile bağırsak kolonizasyonu ve ishal indüksiyonu

Özet

Kaynak: Nag, D. , et.al. Yetişkin Zebrafish modelinde Vibrio kolera kolonizasyonu ve ishalinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, yetişkin zebra balıklarının patojenik Vibrio cholerae sturu ile aşılanmasını ve bağırsak kolonizasyonunu ve hastalık sonuçlarını incelemeyi göstermektedir. Bakteriyel toksinlerin bağırsak bütünlüğünü nasıl bozduğunu, bu da balıkların daha fazla analiz için hazırlanmadan önce sıvı sızıntısına, mukus salgılanmasına ve sulu ishale neden olduğunu gösteriyor.

Protokol

1. Zebra balığının daldırma yoluyla aşılanması
   NOT: Bu maruziyet yöntemi, enfeksiyonun doğal gidişine benzer.
   1. Vibrio cholerae'nin hazırlanması
      1. 5 mL lizojen suyu (LB) ile izole bir V. cholerae kolonisiyle bir LB plakasından aşılanıp 37 °C'de sallanarak (180 rpm) 6–8 saat (gece kültürü) inkübe edin.
      2. 250 mL'lik konik bir şişede 25 mL taze otoklavlanmış LB ortamını, yukarıdaki gece kültüründen 50 μL ile aşılayın. Onu 37 °C'de 16–18 saat boyunca sallayarak (150 rpm) kuluçka edin.
      3. Gece kültürünün 600 nm (OD₆₀₀) optik yoğunluğunu okuyarak millimetre başına bakteri sayısını tahmin etmek için (OD₆₀₀ = 1 ~10⁹ CFU/mL'dir).
      4. Hücreleri 6.000 g santrifüjle 10 dakika boyunca hasat edin. Malzemeyi pipetle çıkarın veya dezenfektan çözeltisine dökün. Hücreleri steril PBS'deki istenen konsantrasyona yeniden süsküyün, genellikle 1 x 10⁷ ile 1 x 10^{10 10} ml PBS arasında bırakın.
         NOT: Burada, 60 mg/L deniz tuzları içeren otoklavlanmış ters osmozlu suyu steril enfeksiyon suyu olarak adlandırılır.
   2. Aşılama ve kuluçka
      1. Dört veya beş zebra balığı, içinde 200 mL steril enfeksiyon suyu içeren 400 mL'lik bir beakere yerleştirin.
      2. 200 mL enfeksiyon suyuna istenen enfeksiyon konsantrasyonunu elde etmek için 1 mL V. cholerae ekleyin (genellikle 5 x 10⁴ ile 5 x 10⁷ CFU/mL) elde edilir.
      3. Balığın dışarı atlamasını önlemek için bedekleri delikli bir kapakla kapatın; 200 μL'lik bir uç kutusunun üstü bunun için iyi çalışıyor.
      4. Her bir beaker'i etiketleyin ve deney süresince 28 °C sıcaklıkta ayarlanmış cam önlü bir kuluçka makinesine yerleştirin.
   3. Geçici maruziyet prosedürü
      NOT: V. cholerae'ye geçici bir maruziyet (genellikle 6 saat) ve ardından aşılanan bakterilerin çıkarılması, bulaşmanın incelenmesi ve dışarı atılan bakterilerin daha doğru nicelendirilmesi için faydalıdır.
      1. 6 saat maruz kaldıktan sonra, balıkları toplamak için bir balık ağından beaker suyunu dökün. Enfekte suyu bir çamaşır suyu kapına atarak V. cholerae'yi öldürür.
      2. Çıkarılan balığı 200 mL steril enfeksiyon suyuna yerleştirin. Balıkların bu temiz suda yüzmesine 5 dakika izin verin, böylece balıktaki yüzey bakterileri gider.
      3. Ağ prosedürünü tekrarlayın ve balığı 200 mL steril enfeksiyon suyundan oluşan yeni bir bedeklere yerleştirin. Deney süresince balıkları bu bedekte tutun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Enstrüman
Kuluçka makinesi	NUAIRE, Plymouth, MN	Otomatik Akış
Malzemeler
400 ml cam beakerler	Pyrex
Delikli kapaklar	Uç kutusundan delikli mikrotip tutucu
Akvaryum Sistemi	Aquaneering, San Diego, CA
RO Su Temizleyici	Aqua FX	TK001
Balık ağı	Marina
Balık yemi	Tetra yüzgeç
Petri plakası	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
1,5 ml santrifüj tüpü	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Test tüpleri	Pyrex	9820
Mikro pipetler	Sartorius Biohit, Göttingen, Almanya	M1000/M200/M20
İpuçları	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB ortamı
Trypton	BD Biosciences, San Jose, CA	211705
Maya ekstraktı	BD Biosciences, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD Biosciences, San Jose, CA	214010