$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Caenorhabditis elegans'ın (C. elegans) bağırsak geçirgenliği üzerindeki farklı bakterilerin etkilerini test etmek için nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarının hazırlanması
- 500 mL'lik bir cam şişeye 1,25 g pepton, 1,5 g NaCl, 8,5 g agar, bir manyetik karıştırıcı ve 487,5 ml damıtılmış su yerleştirin.
- Karışımı iyi karıştırın, 121 °C'de 15 dakika otoklavla geçirin ve karışımı su banyosunda 30 dakika boyunca 55 °C'ye soğutun.
- Su banyosundan ortamı çıkarın, bileşenleri (0,5 mL 1 M CaCl2, 0,5 mL kolesterol, 0,5 mL MgSO4, 12,5 mL KPO4) NGM'ye ekleyin ve iyi karıştırın.
NOT: Kolesterol (mutlak etanolde çözünmüş) hariç tüm bileşenler otoklavlanmalıdır ve her deneme adımı temiz bir tezgahta gerçekleştirilmelidir. - Her 90 x 15 mm Petri kabına 20 mL NGM dağıtın ve agarın oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) temiz bir tezgahta katılaşmasına izin verin. NGM plakaları 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. FITC-dextran (Fluorescein izotiosiyanat-dekstran) boyama için kullanılan NGM plakaları hazırlandı. Her 60 x 15 mm Petri kabına 10 mL NGM dağıtıldı ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) temiz bir tezgahta sertleşmeye bırakıldı. - 4 °C buzdolabından bakteri kültürünü çıkarın ve kültürü NGM plakalarına yaymadan önce iyice vortex yapın.
- Her taze NGM plakasına toplam 800 μL bakteriyel kültür ekleyin ve plakaların gece boyunca 20 °C kuluçka içinde kurumasına izin verin.
NOT: İlk deney için (Şekil 1), E. coli OP50 içeren iki NGM plakası, P . aeruginosa PAO1 içeren bir NGM plakası ve E. faecalis KCTC3206 içeren bir NGM plakası hazırlandı. İkinci deney için (Şekil 2), canlı E. coli OP50 içeren iki NGM plakası, canlı P. aeruginosa PAO1 içeren bir NGM plakası ve ısıyla inaktive edilmiş P. aeruginosa PAO1 içeren bir NGM plakası hazırlandı.
3. Yaşla senkronize C. elegans'ın hazırlanması
- Solucanları sağlam bir NGM plakasında yetiştirin ve istenen popülasyona ulaşana kadar E. coli OP50 ile besleyin.
- Yumurtaları zamanlı yumurta bırakma yöntemi veya ağartma çözeltisi tedavisi kullanarak senkronize edin
4. Bakteri ve FITC-dekstran beslenmesinin tedavisi
- Yaşla senkronize yumurtaları 20 °C'de, NGM tabaklarında 64 saat boyunca kuluçka edin, besin olarak canlı E. coli OP50 ile desteklenir.
- Yaşla senkronize edilmiş L4 larvalarını bir S-tampon ile yıkayın ve onları (yaklaşık 500'den fazla solucan) farklı bakteri ve kimyasallar içeren tedavi NGM plakalarına aktarın. 20 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
NOT: Kullanılan bakteri ve kimyasallara göre tedavi süresi 24 ila 72 saat arasında değişebilir. DIM'in terapötik veya önleyici etkisi ayrıca, solucanlar patojenlerle önceden tedavi edilip ardından DIM (terapötik etki) ile tedavi edilerek veya solucanlar önceden DIM ile tedavi edilip ardından patojenlerle tedavi edilerek (önleyici etki) değerlendirilebilir. - FITC-dekstran takviyeli plakaları hazırlamak için, 2 mL ısıyla inaktive edilmiş E. coli OP50 ile 4 mg FITC-dekstran karıştırın. Daha sonra 100 μL FITC-dextran ve E. coli OP50 karışımını yirmi taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasına izin verin.
NOT: Her NGM plakasında FITC-dextran'ın nihai konsantrasyonu 20 μg/mL olacaktır. - Araç kontrol tedavisi için FITC-dextran içermeyen beş E. coli içeren OP50 içeren NGM plakası hazırlayın. Bu amaçla, her taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) 100 μL ısıyla inaktive edilmiş E. coli OP50 bölünsün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasına izin verin.
NOT: Her bağımsız deney için, on beş FITC-dekstran takviyeli NGM plakası ve FITC-dextran olmayan beş NGM plakası gereklidir. - 48 saatlik tedaviden sonra (7.2. adımdan itibaren), solucanları S-tampon ile yıkayın, solucanları FITC-dextran takviyeli plakalara ve FITC-dekstransız NGM plakalarına aktarın ve plakaları gece boyunca (14–15 saat) kuluçka yapın.
NOT: Her tedavi grubu için 5 FITC-dextran boyama (veya araç kontrol beslemesi) replikası gereklidir. - Solucanları S-buffer ile yıkayın ve taze NGM agar plakasında 1 saat boyunca sürünmelerine izin verin.
NOT: Her bağımsız deney için toplamda 20 taze NGM plakası gereklidir. Bu adımda, NGM plakasını E. coli OP50 ile veya olmadan destekli olarak kullanabilirsiniz. - Siyah 96 kuyu düz tabanlı plakanın her kuyusuna %4 formaldehit çözeltisi 50 μL ekleyin. Her NGM plakasından yaklaşık 50 solucanı floresans ölçümleri için her kuyuya aktarın. 1 ila 2 dakika sonra, her kuyudaki tüm formaldehiti iyice çıkarın ve kuyrukları kaplamak için 100 μL montaj ortamı ekleyin.
NOT: Formaldehit çözeltisi (%4) solucanları hareketsizleştirmek ve onarmak için kullanılır. Her tedavi grubu için, görüntü analizi için 5 kuyuyu (5 kopya) kullanılır.
5. Operetta Görüntüleme Sistemi ile C. elegans'ın görüntülenmesi ve FITC-dextran floresan alımının ölçülmesiyle bağırsak geçirgenliğinin belirlenmesi
NOT: Floresan stereomikroskopi, Operetta sistemi yerine görüntü analizi için kullanılabilir.
- Floresan görüntüleri yakalayın ve Operetta Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi ile floresans yoğunluğunu ölçün ve görüntüleri Harmony yazılımıyla analiz edin.
- Harmony yazılımında, kapağı açmak ve plakayı makineye koymak için Aç simgesine basın.
- Parametreleri kur.
- Kurulum tuşuna tıklayın, plaka tipini (96-well Corning flat-bottom) seçin ve kanalları (parlak alan ve EGFP kanalları) ekleyin.
- Düzeni ayarlayın. Yerleşim seçimine gidin, ardından İzlemeyi seçin ve parametreleri ayarlayın (ilk fotoğraf 1 μm, düzlem sayısı 10, mesafe 1 μm).
- Bir tedavi kuyusu ve bir yakalama alanı seçin ve Deney bölümünde görüntülerin tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için Test tuşuna basın.
- Fotoğraflar tatmin edici ise, Kurulum bölümüne geri dönüp ekranın sonundaki Reset simgesine basın. Sonra, tüm hedef kuyruklarını ve uygun sayıda yakalama alanını seçin.
- Tekrar Deneyi Çalıştır bölümüne gidin ve plaka adını girin, ardından İşleme başlamak için Start tuşuna basın.
- Floresans yoğunluğunu ölçmek için görüntü analiz bölümüne gidin ve görüntüyü girin. Hücreyi EGFP (Gelişmiş yeşil floresan protein) kanalı ve yöntemi B seçerek bulun. Ortak eşik değerini 0.5'e, alanı >200μm2'ye, bölünme faktörünü 3.0'a, bireysel eşiği 0.18'e ve karşılaştırmayı 0.18'in üzerine ayarlayın. Sonra, yoğunluk özelliklerini hesaplayın ve çıktı olarak ortalamayı seçin. Kurulumu kaydetmek için Apply simgesine basın.
- Yoğunluğu ölçmek için bir ısı haritası ve veri tablosu elde etmek için Değerlendirme bölümüne gidin. Okuma parametresini Hücreler — Yoğunluk Hücresi EGFP Ortalama — Kuyu başına ortalama olarak ayarlayın ve değerlendirmeye başlayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Operetta'dan veri çıkarmak için Settings butonuna tıklayın ve Veri yönetimi'ni seçin.
- Arşiv yaz seçeneğini seçin, ardından gezinmeyi açıp dosyayı seçin.
- Dosyayı seçmek için sol köşedeki küçük + sinyaline tıklayın, ardından Ölçüm'e tıklayın ve Plaka adını seçin.
- Dosyayı seçin ve Tamam'a tıklayın.
- Dosyayı kaydetmek için aktif yolda Göz atma sinyaline tıklayarak yolu seçin.
- Veri dosyasını kaydetmek için Başlat'a tıklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
