$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Salmonella Typhimurium ΔAroA kültürlerinin farelerin oral garajı için hazırlanması
- S. Typhimurium ΔAroA'nın donmuş gliserol stokundan, steril aşılama döngüsüyle 100 μg/mL streptomisin içeren Luria-Bertani agar (LB agar) ile bir çizgi plakası hazırlanır. Gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın. Çizgi plakaları 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
- Enfeksiyondan bir gün önce, antibiyotiği 2,5 mL suda 0,5 g streptomisin eriterek hazırlayın. Streptomisin çözeltisi filtre sterilizasyonundan sonra, fareleri ampullü 22G gavaj iğnesi ve 1 mL şırınga ile 100 μL streptomisin çözeltisi (20 mg streptomisin/doz) kullanarak ağızdan gave yapın. Aşılama döngüsü kullanarak, tek bir koloni içeren bir kültür tüpünde 3 mL LB suyu (50 μg/mL streptomisin) aşılayın. Salmonella kültürünü gece boyunca 37 °C'de aerobik olarak inkubasyon ile 200 Devrim/Dakika (RPM) ile sallayın.
- Enfeksiyon gününde, steril Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde ardışık 2 adet 1/10 seyreltme uygulanarak son enfeksiyon dozunu hazırlayın. Bu, yaklaşık 3 x 106 Koloni Oluşturma Birimleri (CFU) içeren 100 μL bir aşı elde edilmesiyle sonuçlanacaktır.
- Soğanlı uçlu 22G gavaj iğnesi ve 1 mL enşırınga kullanarak, her fareyi hazırlanan 100 μL Salmonella ile gajele yapın.
NOT: Salmonella kültürlerini aseptik tekniklerle hazırlayın. Salmonella'nın nihai aşı konsantrasyonu, LB agar üzerine streptomisin ile seri seyreltmeler uygulanarak doğrulanabilir.
2. Dokularda Salmonella yüklerinin değerlendirilmesi
- 2 mL güvenli kilitli, yuvarlak tabanlı mikrotüpler 1 mL steril PBS ve otoklavlanmış paslanmaz çelik boncuk hazırlayın. Tüpleri doku toplamadan önce önceden tartın.
- Karbondioksit maruziyetiyle ötenazi yapılan farelerden alınan sek ve dalak dokularını kesiklemek. Bireysel hayvanlardan dokuları ayrı tüplerde toplayın. Tüpleri tartarak doku ağırlıklarını belirleyin.
- Mikser frezesi cihazı kullanılarak 30 Hz'de 15 dakika boyunca homojenleştirin. 96 kuyu başına 900 μL PBS 2 mL mega blokta aktarın. 100 μL doku pipeti ilk kuyuya homojenlenir, iyi karıştırır ve sonraki kuyulara 100 μL ekleyerek seri seyreltme yapar ve 10⁻⁶ seyreltme elde edilene kadar. Her seyreltmeden 10 μL levha üçlü olarak LB agar'a 100 μg/mL streptomisin içerir.
- Ortalama CFU'yu 100 katla çarpın çünkü 1000 μL numunenin 10 μL kaplanmıştı ve uygun seyreltme faktörü belirlendi. Doku ağırlığının toplam CFU'sunu doku ağırlıklarına bölerek doku gramı başına CFU belirlenir.
NOT: Tüm örnekleri doku işleme sırasında buz üzerinde veya 4 °C'de tutun. Doku homojenatlarıyla seri seyreltme yaparken geniş delikli pipet uçları kullanın. PBS içeren 96 kuyu megabloğunu önceden hazırlayın.