Farelerde Tekrarlayan İdrar Yolu Enfeksiyonlarını Modellemek İçin Gardnerella vaginalis Inoculumun Hazırlanması

Özet

Kaynak: O'Brien, Başkan Yardımcısı ve diğerleri. Gardnerella vaginalis mesane maruziyeti ile tetiklenen tekrarlayan Escherichia coli idrar yolu enfeksiyonu, farelerde ortaya çıkmıştır. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonu için fare modeli oluşturmak için Gardnerella vaginalis inokulumunun hazırlanmasını göstermektedir.

Protokol

1. Gardnerella vaginalis inoculumu hazırlayın
   NOT: Tüm adımlar anaerobik bir odada gerçekleştirilir. İdeal kültür kuluçka süreleri, G. vaginalis'in farklı suşları arasında değişiklik gösterir; bazı suşlar durağan faza girer ve hatta diğerlerinden daha hızlı ölmeye başlar. Bu nedenle, belirli bir suş için kuluçka süreleri, farelerde deneyler yapılmadan önce ampirik olarak belirlenmelidir. Bu modelde G. vaginalis'in diğer veya tüm suşlarının aynı etkileri tetikleyip tetiklemediği bilinmemektedir.
2. Streak G. vaginalis süzümü -80 °C dondurucu stokundan NYCIII plakasına (antibiyotiksiz) kalın. Plakayı 37 °C'de anaerobik olarak 24 saat kuluçka yapın.
3. Anaerobik odada, NYCIII plakasından 1 μL hücre dolusu (tek bir koloni yetersiz olan) 5 mL anaerobik NYCIII ortamını aşılayın ve anaerobik koşullarda 37 °C'de 18 saat boyunca statik bir kültür inkübe yapın. Büyüme ortamına antibiyotik eklemeyin.
4. Kültürün^{OD 600'ünü} spektrofotometre kullanarak belirleyin
   1. Kültürün tanımlanmış bir hacmini (X) 9600 × g ile 1 dakika boyunca santrifüj edin ve ortamı aspire edin. Aşağıdaki denklemi kullanarak 50 μL'de istenen inaşılum optik yoğunluğuna (OD) ulaşmak için pelleti yeniden askıya almak için fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) hacmini (Y) hesaplayın: X mL × ODculture = Y mL × OD ^inokulum, YY = (X ml × OD kültürü) / OD ^inokulum için çözün
      NOT: JCP8151B^SmR için OD ^inokulum 5'tir, ancak bu diğer G. vaginalis suşları için ampirik olarak belirlenmelidir. Örneğin, bir JCP8151B^SmR'nin 3 mL sıvı kültürünü gece boyunca eğiriyorsa ve ODculture = 2.0: Y= (3 mL × 2.0) / 5.0; bu nedenle, 1.2 mL PBS içinde tekrar süzülme pelleti kullanılır.
   2. Bakteriyel pelleti PBS içindeki istenen konsantrasyona yeniden süsküyün. Aşıyı seri olarak seyreltir ve plakayla örtün, böylece her deneyde kullanılan gerçek aşı dozunu belirleyin. Sadece OD değerlerine güvenmeyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Glikoz	Sigma	G7528	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)	Cellgro	25-060-Cl	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
Sodyum klorür	Sigma	S3014	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
Proteoz pepton #3	Fisher	DF-122-17-4	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
Maya ekstraktı	Fisher	DF0127-17-9	NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı için
Spektrofotometre	BioChrom	80-3000-45	Bakteriyel OD600 ölçülmesi
Streptomisin	Gibco	11860038	G. vaginalis NYCIII seçici plakaları (1 mg/mL) ekleyin