Viral Ortak Enfeksiyon Sonrası Streptococcus pneumoniae'nin Patojenik Geçişini İnceleyen Fare Modeli

Özet

Kaynak: Lenhard, A. ve diğerleri. Streptococcus pneumoniae'nin viral eş-enfeksiyon sonrası kolonizerden patojene geçişi için fare modeli, yaşa bağlı hastalığı özetliyor. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, grip virüsünün Streptococcus pneumoniae'nin kolonizatordan patojene geçişini tetiklediği bir fare ortak enfeksiyon modelini gösteriyor. Bakteriyel kolonizasyon, viral enfeksiyon ve hastalık ilerlemesiyle ilgili adımları özetler.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Biyofilm ile yetiştirilen Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) ile farelerin burun içi aşılanması

1. Fare satın alın ve istediğiniz yaşta kullanın.
   NOT: Genç konakları modellemek için 3-4 aylık fareler tercih edilirken, 21-24 aylık fareler >65 yaşındaki yaşlı bireyleri modellemek için kullanılabilir. Burada sunulan veriler C57BL/6 erkek farelerden alınmıştır.
2. Biyofilm ile yetiştirilen bakteriyelleri buzda eritin ve 1.700 × g'de 5 dakika boyunca spin yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarıp pelleti bozmadan atın, bakteriyi 1 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) süzülerek yıkayın ve 1.700 × g üzerinde 5 dakika boyunca tekrar döndürün. Süpernatantı çıkarın ve pelleti istenen konsantrasyona ulaşmak için gereken hacimde yeniden askıya alın (intranazal aşılama için 5 ×^{10 6 koloni} oluşturan birim (CFU)/10 μL hedefleyin). Hazırlanan aşıyı kan agar plakalarına kaplama yaparak uygulanan bakteri miktarını doğrulayın.
3. Fareleri, inceltilmiş inokulumdan 5 μL pipetle her bir narise pipet ederek 5 × 10⁶ CFU ile intranazal aşılanın. Fareleri sağlam tutarak başı stabilize edin, hacim soluyana kadar (genellikle hacmi narelere pipet ettikten saniyeler içinde) emin olun. Bu adımı, aşılının akciğer aspirasyonunu önlemek için anestezi olmadan gerçekleştirin.

2. Grip A virüsü (IAV) ile viral enfeksiyon

1. S. pneumoniae ile burun içi aşıdan 48 saat sonra, ilgilenen IAV suşunu buz üzerinde çözerler.
   NOT: Burada sunulan veriler, iş birliği yoluyla elde edilen fare adapte edilmiş bir grip A virüsü A/PR/8/34 H1N1 sızına aittir.
2. Virüs çözüldükten sonra, PBS içindeki virüs istenen konsantrasyona kadar seyreltilmiştir; intratrakeal enfeksiyon için 20 plak oluşum birimi (PFU)/50 μL ve intranazal enfeksiyon için 200 PFU/10 μL hedeflenmektedir. Sahte enfekte ve sadece bakteri içeren gruplar için, fareleri aşılamak için PBS kullanın.
3. Anestezi öncesi farelerin gözlerine göz yağlayıcısı yerleştirin. Fareleri %5 izofluran ile anestezi yapın ve anestezi sıkı bir parmak sıkıştırmasıyla doğrulayın.
4. Hayvan anestezi edildikten sonra, izofluran odasından çıkarılır ve anestezi altındaki fareleri hemen intratrakeal olarak 50 μL (20 PFU) IAV ile enfekte ederek dil ağzından çıkarılır ve trakeadan aşağı indirilen sıvı hacmini pipetlenir.
5. Fareleri ayrı bir kafese yerleştirin ve tam iyileşmeye kadar izleyin (göğsün üzerinde dik yatabilirler) sternumbasyon pozisyonunu koruyabilirler).
6. İyileşmenin ardından, farelere hemen 10 μL (200 PFU) IAV aşısı uygulanarak 1.3. adımdaki aşılama yöntemi uygulanır.
7. Aynı enfeksiyon grubuyla tek veya çift bakteriyel ve viral enfeksiyon geçiren ve diğer gruplardan ayrılmış ev fareleri.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4-Aminobenzoik asit	Fisher	AAA1267318	Mix I stok
100 μm Filtreler	Fisher	07-201-432
BD Intramedic Polietilen Boru	Fisher	427410	Burun yıkama için tüp
Luer-Lok uçlu BD tek kullanımlık şırıngalar (1 mL)	Fisher	14-823-30
D39	Ulusal Tip Kültürü Koleksiyonu (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae suşu
Pivetal İzofluran	Patterson Veterinerliği	07-893-8440	Enfeksiyon sırasında anestezi için izofluran
Gentamisin ile Termo Bilimsel Kan Agarı	Fisher	R01227	Kan agarları antibiyotik gentamisin ile
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae suşu