$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Enfekte dokuların bakteriyel sayım için işlenmesi
- Akciğer koleksiyonu
- Diseksiyon makası kullanarak, açıkta kalan kaburga kafesinin yanlarını kesin ve kaburgaları farenin başına doğru nazikçe yukarı çekerek kalbi ortaya çıkarın. Fosfatla tamponlanmış salin (PBS) ile önceden doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve yavaşça perfüze etmeye başlayın. Akciğerlerin ağartılmasını başarılı perfüzyonun göstergesi olarak arayın. Akciğer dokusunu kırılmamak için yavaşça suyla çekin.
- Forsepsle kalbi kaldırın ve akciğerler ile kalbi ayıracak bir kesik açın. Ayrıldıktan sonra, akciğerin tüm loblarını forsepsle alıp steril PBS içeren bir kabta durulayın ki kalan kanı gidersin. Petri kabında akciğerleri küçük parçalara ayırın ve iyi karıştırın. Bakteriyel koloni oluşturan birimlerin (CFU) veya viral plak oluşum birimlerinin (PFU) belirlenmesi için akciğer karışımının yarısını çıkarın ve homojenleştirme için 0,5 mL PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak tabanlı 15 mL tüpte yerleştirin.
NOT: Aynı akciğerin farklı loblarını çeşitli değerlendirmeler için almamak önemlidir. Bunun yerine, tüm loblar doğranmalı, iyi karıştırılmış ve farklı değerlendirmeler için eşit şekilde ayrıştırılmalıdır.
- Toplanan dokuyu homojenleştirmek için, önce homojenizer probunu %70 etanol içine koyup homojenizörü %60 güçte 30 saniye çalıştırarak temizleyin. Bu adımı steril suda 10 saniye tekrarlayın. Her dokuyu 1 dakika boyunca homojenize edin. Homojenizer probunu her örnek arasında steril suda ve her organ ile örnek grubu arasında taze bir tüpte temizleyin.
- Bakteri sayılarının sayımı
- Tüm organlar çıkarılıp homojenleştirildikten sonra, kan agar plakalarında seri seyreltmeler yapılır. Toplam CFU'yu hesaplamak için, her örnek için 10 μL ile plaka ve son hacmi mL cinsinden not edin. Gece boyunca 37 °C/%5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.