Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek İçin Bariyer Fonksiyonlu İnsan Kolonoid Monotabakasının Oluşturulması

Özet

Kaynak: J. G. ve diğerleri. Patojenler, kommensallar ve konak bağırsak epitelleri arasındaki etkileşimleri incelemek için insan kolonoid monokatmanlar. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, kolajen kaplı bir Transwell sisteminde kolondan kaynaklı epitel hücrelerinin kültürlenmesi prosedürünü gösteriyor; böylece bağırsak bariyerini modelleyen ve konak-patojen-patojenler etkileşim çalışmalarını mümkün kılan mukus üreten bir monotabaka oluşturuluyor.

Protokol

1. Enteroid/kolonoid süspansiyonunun kaplaması

1. Kaplamalı insertler 4 °C'de saklandıysa, hücre kaplamasından önce en az 30 dakika boyunca 37 °C/%5_CO2 doku kültürü inkübatöründe dengelenin.
2. Her kaplama için 1 mL sıcak (25-37 °C arasında) genleşme ortamı (EM) hazırlanın ve 10 μM Y-27632 ile 10 μM CHIR 99021 ekleyin.
   NOT: EM, B27 (1x) içeren İleri DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) /F12, %50 WNT3A koşullu ortam, %15 RSPO1 koşullu ortam, %10 Noggin ile koşullandırılmış ortam, 50 ng/mL insan EGF (Epidermal Büyüme Faktörü), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiyotik/antimikotik kokteyl (1x), 10 mM HEPES (N-(2-Hidroksietil)piperazin-N'-(2-etansülfonik asit)) içerir), L-alanil-L-glutamin dipeptid (1x) ve penisillin-streptomisin (1x) (bkz. Materyaller Tablosu).
3. Hücre pelletini içeren tüpten yıkama ortamını aspire edin ve en az 100 μL/insert verecek kadar EM hacminde yeniden süzülün.
4. Her insertten kolajen IV çözeltisini aspire edin ve her insertte 150 μL yıkama ortamı ile iki kez yıkayın.
5. Her bir insertin altındaki boşluğa 600 μL EM pipet yapın.
6. Her inserte 100 μL hücre süspansiyonu pipet yapın.
7. Plakayı doku kültürü kuluçka makinesine geri götürün ve en az 12 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
   NOT: Insert membranında kolonoid parçalarının dengesiz dağılımı önlemek için plakayı sarsmaktan veya keskin eğitmekten kaçının.
8. Plakayı faz kontrastlı ışık mikroskobu, 2.5x-10x objektif lens altında yerleştirerek birleşen bir tek katman oluşturmak için hücre tutunmasını ve yayılmasını izleyin.
9. 1-2 gün sonra, çoğu parça kolajen matriksine yapışmalıdır. Kültür ortamını yenileyin ve Y-27632 ile CHIR 99021 ile tedaviyi durdurun. Karışıma ulaşana kadar her 2-3 günde bir ortamı yenilemeye devam edin. Uyum genellikle 7-10 gün içinde sağlanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propanediol	Sigma	T4661	Tris bazı, liz tamponunun bileşeni
A-83-01	Tocris	2939	ALK4/5/7 inhibitörü
Asetik asit, buzul	Fisher Scientific	A38
İleri DMEM/F12	Yaşam Teknolojileri	12634-010	Büyüme ortamının bileşeni
Antibiyotik/antimikotik kokteyli	Invivogen	ant-PM-2	Primocin (100x)
B27, 50x	Yaşam Teknolojileri	17504-044	Büyüme ortamının bileşeni
Hücre kültürü insertleri	Corning	3470	Transwell, PET membran, 0.4 μm gözenek, 24 kuyruklu plaka
CHIR 99021	Tocris	4423	GSK3β inhibitörü
İnsan plasentasından alınan kolajen IV	Sigma	C5533
Cultrex Organoid Hasat Çözümü	Trevigen	3700-100-01	Bazaz zar matrisini depolimerize eder
Etanol, kesinlikle	Pharmco	111000200
GlutaMAX	Yaşam Teknolojileri	35050-061	L-alanil-L-glutamin dipeptidi, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc hücre hattı	van den Brink laboratuvarı, Tytgat Karaciğer ve Bağırsak Araştırmaları Enstitüsü		Noggin ile koşullandırılmış ortam üretimi için
HEK293T/RSPO1-Fc-HA hücre hattı	Trevigen	3710-001-K	Rspondin-1 koşullandırılmış ortam üretimi için
HEPES, 1 M	Yaşam Teknolojileri	15630-080	Büyüme ortamının bileşeni
İnsan epidermal büyüme faktörü (EGF)	Ar-Ge Sistemleri	236-EG-01M	Büyüme ortamının bileşeni
Ters hücre kültürü ışık mikroskobu	Olympus	CKX51
L-WNT3A hücre hattı	ATCC	CRL-2647	Wnt3a koşullu ortam üretimi için
Matrigel, büyüme faktörü azaltılmış	Corning	356231	3D kültür için bazal membran matrisi
Mini hücre kazıyıcı	United BioSystems	MCS-200
MUC2 antikor, fare monoklonal	Abcam	AB11197	İmmünboya için 1:100, immünoblotasyon için 1:500 derecesinde kullanın
MUC2 shRNA lentiviral parçacıkları	GE Dharmacon	RHS4531	GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583
Yörünge sallayıcısı	Grant Enstrümanları	PSU-10i
Penisillin-streptomisin, 100x	Yaşam Teknolojileri	15140-122	Büyüme ortamının bileşeni
Mikrouçlu sonikator prob sonikatoru	Branson Ultrasonik	450
Memeli hücreleri için proteaz inhibitörü kokteyli	Sigma	P8340	Liz tamponunun bileşeni
SB 202190	Tocris	1264	p38 MAPK inhibitörü
Sodyum klorür	Sigma	S3014	Liz tamponunun bileşeni
Sodyum deksoykolat	Sigma	D6750	Liz tamponunun bileşeni
Sodyum dodesil sülfat	Sigma	L3771	Liz tamponunun bileşeni
TrypLE Express, 1x	Yaşam Teknolojileri	12605-010	Enteroid/kolonoid parçalarını sindirmek için tripsin
Vinculin antikoru, tavşan monoklonal	Abcam	AB129002	İmmünoblotasyon için 1:1000 derecesinde kullanın
Su, doku kültürü derecesi, steril filtrelenmiş	Corning	25-055
Y-27632	Tocris	1254	RhoA/ROCK inhibitörü