Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

Özet

Kaynak: Figueroa, D. ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastlar ve protoplastların üretimi ve görselleştirmesi. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, çubuk şeklinde, gram-negatif bakterilerden sferoplastların hazırlanmasını gösteriyor. Bakteriler, bir antibiyotik varlığında yetiştirilerek uzun filamentler oluşturur. Bunlar hipertonik bir çözeltiyle yıkanır ve dış hücre duvarını çıkarmak için liz tamponu ile işlenilir. Hipotonik tedavi, soğutulmuş izotonik çözeltiyle stabilize edilen ve soğuk koşullarda saklanan sferoplastlar oluşturur.

Protokol

1. Çözelti Hazırlığı

NOT: Escherichia coli (E. coli) sferoplastları üretmek için 1.1–1.9. adımlarda tanımlanan çözeltiler hazırlanır

1. 1 M tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorürit (Tris-Cl), pH 7.8, 10.34 g Tris·HCl ve 4.17 g tris(hidroksimetil)aminometan (Tris·OH) 50 mL damıtılmış suda (dH₂O) 125 mL şişede çözünerek hazırlanır. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
2. A çözeltisi (20 mM magnezyum klorür (MgCl₂), 0,7 M sakaroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) ve 11,98 g sukroz (342,3 g/mol) 25 mL dH₂O içinde 125 mL bir şiş....

Sonuçlar

Şekil 1: Escherichia coli'nin temsil eden görüntüleri. (A) E. coli bakterisi, (B) E. coli yılanı ve (C) E. coli sferoplastı. Görüntüler 100X büyütme ile çekildi.

....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Trizma hidrokloridi (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma üssü (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnezyum klorür	Sigma	M8266
Sucrose	Sigma	S7903
Lizozim	Sigma	L6876
Deoksiribonükleaz I	Sigma	D4527
Etilenediamintetraasetik asit	Sigma	106361	Orijinal protokol geliştirmede Sigma 106361 kullandı; 106361 yerine ED2SS ile üretimi sona erdi
Sefaleksin hidratı	Sigma	C4895
BBL Triptikaz soya suyu	Fisher Scientific	B11768
Maleik asit	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Şırınga Filtresi 0.2 μm HT Tuffryn Membran ile	Pall Corporation	4192