Gram-negatif bakterilerden sferoplastların üretimi

Özet

Kaynak: Figueroa, D. ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastlar ve protoplastların üretimi ve görselleştirmesi. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, çubuk şeklinde, gram-negatif bakterilerden sferoplastların hazırlanmasını gösteriyor. Bakteriler, bir antibiyotik varlığında yetiştirilerek uzun filamentler oluşturur. Bunlar hipertonik bir çözeltiyle yıkanır ve dış hücre duvarını çıkarmak için liz tamponu ile işlenilir. Hipotonik tedavi, soğutulmuş izotonik çözeltiyle stabilize edilen ve soğuk koşullarda saklanan sferoplastlar oluşturur.

Protokol

1. Çözelti Hazırlığı

NOT: Escherichia coli (E. coli) sferoplastları üretmek için 1.1–1.9. adımlarda tanımlanan çözeltiler hazırlanır

1. 1 M tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorürit (Tris-Cl), pH 7.8, 10.34 g Tris·HCl ve 4.17 g tris(hidroksimetil)aminometan (Tris·OH) 50 mL damıtılmış suda (dH₂O) 125 mL şişede çözünerek hazırlanır. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
2. A çözeltisi (20 mM magnezyum klorür (MgCl₂), 0,7 M sakaroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) ve 11,98 g sukroz (342,3 g/mol) 25 mL dH₂O içinde 125 mL bir şişede çözünerek hazırlanın. 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ekleyin ve hacmi 50 mL'ye ayarlayın. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
3. B çözeltisi (10 mM MgCl₂, 0.8 M sukroz, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) 0.05 g MgCl₂ (95.2 g/mol) ve 13.69 g sukroz (342.3 g/mol) karışımını 25 mL dH₂O içinde 125 mL bir şişede çözünerek hazırlayın. 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) ekleyin ve hacmi 50 mL'ye ayarlayın. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
4. 13,69 g sukrozu (342,3 g/mol) 50 mL dH₂O'da 125 mL şişede çözerek 0,8 M sukroz hazırlayın. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
5. 5 mg/mL deoksiribonukleaz I (DNaz I) hazırlanır; 0,015 g DNaz I'yi 3 mL dH₂O'da 50 mL bir şişede çözerek alın. 0,2 μm membranlı 25 mm şırınga filtresinden filtreleyerek sterilize edin. Aliquot çözeltisi mikrofuge tüplerine alınır ve −20 °C'de saklanır.
6. 0.125 M etilen diamintetraasetik asit (EDTA), pH 8.0, 0.698 g EDTA disodyum dihidrat (372.2 g/mol) içinde 125 mL dH₂O içinde 125 mL bir şişede çözünerek hazırlanır. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.
7. 600 μg/mL sefaleksin hazırlayın; 0,03 g sefaleksin hidratı (365,404 g/mol) 50 mL dH₂O'da 125 mL'lik bir şişede çözülür. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membranlı filtreden geçirerek sterilize edin ve 4 °C'de konik bir tüpte saklanın.
8. 5 mg/mL lizozim, 3 mL dH₂O içinde 50 mL bir şişede çözünerek 0.015 g lizozim hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm şırınga filtresinden filtreleyerek sterilize edin. Aliquot çözeltisi mikrofuge tüplerine alınır ve −20 °C'de saklanır.
9. 30 g TSB'yi 1 L dH₂O'da 2 L şişede çözerek %3 Triptikaz Soya Suyu (TSB) ile hazırlanın. Çözeltiyi 25 mL veya 100 mL TSB içeren şişelere alarak sırasıyla E. coli sferoplastları veya B. megaterium protoplastlarının hazırlanmasında kullanılır. Sıvı ortamı sterilize etmek için otoklav termosları. Steril TSB oda sıcaklığında veya 4 °C'de saklanabilir.
10. 100 mL dH₂O'da 250 mL bir şişede 34,23 g sukroz (342,3 g/mol), 0,46 g maleik asit (116,07 g/mol) ve 0,38 g MgCl₂ (95,21 g/mol) çözünerek C çözeltisi (1 M sukroz, 0,04 M maleat, 0,04 M MgCl₂, pH 6,5) hazırlanır. pH 6.5'e ayarlayın. 25 mm şırınga filtresinden ve 0,2 μm membrandan geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklanın.

2. Gece Kültürünün Hazırlanması

NOT: 2-3. bölümleri uygun steril tekniklerle gerçekleştirin. Istenirse, bir bakteri suş potansiyel kontaminasyonu azaltmak için antibiyotik direnci için bir plazmid içerebilir. Antibiyotik direnci olan bir suş kullanıyorsanız, gerekli antibiyotikleri 2.1 ve 3.1–3.2. adımlarda ekleyin.

1. Steril pipet ucu kullanarak tek bir bakteri kolonisi seçip 2–3 mL %3 w/v TSB içeren 14 mL'lik kültür tüpüne yerleştirerek gece boyunca kültür hazırlayın. 37 °C'de kuluçka içinde, 16–21 saat boyunca sallanarak inkubasyon yapılır.

3. Gram-negatif E. coli Spheroplasts'ın Hazırlanması

1. 250 mL'lik bir şişede, gece kültürünü %3 w/v TSB olan 25 mL hacimde 1:100 hassasiyetinde seyreldin ve bakteriyel çözeltiyi 37 °C'de inkübe edin; yaklaşık 2,5 saat boyunca çalkalayın, ta ki çözelti 600 nm'de 0,5–0,8 optik yoğunluğa ulaşana kadar. Optik yoğunluğu bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
2. 250 mL'lik bir şişede, bu kültürü %3 w/v TSB oranında 30 mL'de 1:10 oranında seyreltir ve 37 °C'de kuluçka yaparken, 60 μg/mL sefaleksin (347,4 g/mol) varlığında 2,5 saat çalkalayın; böylece yaklaşık 50–150 μm uzunluğunda tek hücreli filamentler elde edilir; bu filamentler ışık mikroskobu ile 1.000X büyütme altında gözlemlenebilir (Şekil 1B).
3. Filamentleri bakteriyel çözeltiyi 1.500 x g, 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüjlenerek hasat edin. Süpernatantı boşaltıp at, peleti ayırın.
4. Filamentleri 1 mL 0,8 M sukroz ekleyerek nazikçe yıkayın, pelleti rahatsız etmemeye dikkat edin. 1 dakika kuluçka yapın, ardından üst malzemeyi pelleti rahatsız etmeden atın.
5. Pellete 150 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 μL 5 mg/mL lizozim, 30 μL 5 mg/mL DNaz I ve 120 μL 0.125 M EDTA ekleyip çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka edin.
6. 1 mL çözelti A'yı 1 dakika boyunca yavaş yavaş 3.5 ölçüsünde hazırlanmış çözeltiye mikropipet kullanarak ekleyin ve çözeltiyi elle nazikçe döndürün. Çözeltiyi oda sıcaklığında 4 dakika kuluçka yapın.
7. 7 mL 4 °C çözeltisi B'yi iki adet 15 mL konik tüpe koyun. Bu iki tüpün her birine 3.6'da hazırlanmış çözeltiyi eşit miktarda ekleyin. Çözeltiyi 1.500 x g, 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Serolojik pipet kullanarak, 1-2 ml süpernatantın tamamını dikkatlice çıkarın, pelleti rahatsız etmeden. Pelleti P1000 mikropipeti kullanarak nazikçe yukarı aşağı pipetle yeniden askıya alın. Bir ışık mikroskobu ile örneği 1.000X büyütmede gözlemleyerek sferoplastların oluşumunu görsel olarak kontrol edin (Şekil 1C).
9. Sferoplastları -20 °C'de bir haftaya kadar veya 3 donma-erime döngüsünden geçene kadar sakla.

Sonuçlar

Şekil 1: Escherichia coli'nin temsil eden görüntüleri. (A) E. coli bakterisi, (B) E. coli yılanı ve (C) E. coli sferoplastı. Görüntüler 100X büyütme ile çekildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Trizma hidrokloridi (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma üssü (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnezyum klorür	Sigma	M8266
Sucrose	Sigma	S7903
Lizozim	Sigma	L6876
Deoksiribonükleaz I	Sigma	D4527
Etilenediamintetraasetik asit	Sigma	106361	Orijinal protokol geliştirmede Sigma 106361 kullandı; 106361 yerine ED2SS ile üretimi sona erdi
Sefaleksin hidratı	Sigma	C4895
BBL Triptikaz soya suyu	Fisher Scientific	B11768
Maleik asit	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Şırınga Filtresi 0.2 μm HT Tuffryn Membran ile	Pall Corporation	4192