Vajinal Grup B Streptococcus Enfeksiyonunun Fare Modeli Oluşturulması

Özet

Kaynak: Patras, K. A., Doran, K. S. Grup B Streptococcus vajinal kolonizasyonunun fırın modeli. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, enfeksiyonu modellemek için Grup B Streptococcus ile hormon tedavisi görmüş dişi bir farenin vajinal aşılanmasını ve hazırlanmasını göstermektedir. Bakterilerin nasıl kültürleneceği ve hazırlanacağı, aşının vajinal lümene nasıl uygulanacağı ve enfeksiyonun başarılı olmasını nasıl sağlayacağı açıklar.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Grup B Streptokokk (GBS) ile vajinal aşılama

1. Aşılamadan bir gün önce, ilgi gören GBS suşunun gece boyunca 5 ml'lik sıvı kültürü, örneğin A909 (serotip Ia), Todd Hewitt çorbasında (THB) 37 °C'de yetiştirin.
2. GBS'yi gece boyunca 1:10 hacimde taze THB'ye alt kültüre geçirin ve 37 °C'de kuluçka yapın. Bakteriyi orta log fazına (OD₆₀₀ = 0.4-0.5) kadar büyütün.

NOT: Bu genellikle GBS'nin türüne bağlı olarak 2-3 saat sürer.

3. Alt kültürü steril 15 ml'lik konik tüplere ve pellet bakterilerine 3.000 × g 5 dakika boyunca aktarın. Üst natantı aspire edin. Bakteriyel pelleti 200 μl steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) içinde yeniden süzülür.
4. Yeniden askıya alınmış pellet kullanılarak, 3 - 5 ml PBS (10 farede 1 ml) tam olarak OD₆₀₀ = 0.4 olarak yeni 5 ml'lik kültür tüpünde alın. Bu, ~ 1 × 10⁸ koloni oluşturan birim (CFU)/ml konsantrasyon olacaktır. Yeni 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve bakteriyi 3.000 × g'de 5 dakika boyunca tekrar pellet edin. Üst natantı aspire edin.
5. Pelleti PBS'de orijinal hacmin 1/10'u ile yeniden askıya alın. Örneğin, 3 ml OD₆₀₀ = 0.4 pellet edildiyse, 300 μl PBS ile tekrar süzülür.

NOT: Bu, hayvan aşısı için kullanılan son bakteriyel süspansiyondur (~ 1 × 10⁹ CFU/ml).

6. Bu süspansiyondan 50 μl'sini seri seyreltme ve THB agar'da kaplama için ayırın, böylece tam aşı belirlenir.
7. Her fareye son bakteri süspansiyonundan 10 μl aşı yapın, böylece her fareye 1 × 10⁷ CFU uygulanır.
   1. Aşılamak için, fareyi elle elle tutun; gevşek deriyi sap kısmındaki kabuğu başparmak ile işaret parmağı arasında sabitleyip kuyruğu hareketsiz hale getirin.
   2. GBS'nin 10 μl'sini 200 μl jel yüklemeli pipet ucuna çekin. Ucu vajinal lümenin içine 5 ila 10 mm kadar yerleştirin ve 10 μl inokulum dağıtın.
      NOT: Jel yükleme uçları, organ travması veya yaralanma riskini en aza indirmek için, özellikle genç veya küçük farelerde standart 200-μl uçlara göre tercih edilir.
   3. Aşılamadan hemen sonra, boynun kaçığını serbest bırakın ve farenin arka ucunu kaldırın, fareyi kuyruğundan tutup ön patilerini sert bir yüzeyde ~ 1 dakika boyunca yürütün.
   4. Vajinal açıklığı görsel olarak inokulum geri akıntısı olup olmadığını inceleyin. Geri akış gözlemlenirse, vajinal açıklığı manipüle etmek veya büyütmek için taze bir pipet ucu kullanılabilir ve böylece geri akışın lümen'e çekilmesini kolaylaştırır. Ayrıca, geri akış pipetle aspire edilip yeniden aşılanabilir.
      NOT: Topikal ajanlar, probiyotik organizmalar veya ilgi çekici proteinler uygulanırsa, vajinal yolda fizyolojik bir tamponda 20 μl'ye kadar bir hacim verilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
200 μl jel yüklemeli pipet uçları	USA Scientific	1252-0610
Todd Hewitt Bulvarı	Hardy Diagnostics	7161C
Dulbecco'nun Fosfatla Tamponlu Tuz Çözeltisi 1x	Corning	21-031-CV