Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Özet

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması. J. Vis. Exp. (2016)

Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları yoğun biyofilm oluştururken, aranmış kuyular oluşumu azalmıştır. Biyofilmi boyamak için katyonik boya kullanılır ve biyokütle değerlendirmek için emilimcilik ölçülür.

Protokol

1. A. baumannii S1'de Biyofilm Oluşumunun Kristal Mor Nicelenmesi

1. Acinetobacter baumannii S1(A. baumannii) kültürünü Lizogeni suyu (LB) içinde (tripton 10 g/L, maya ekstraktı 5 g/L) 30 °C'de sallanma inkuluçkasında (220 rpm) 16 saat boyunca yetiştirin.
2. A. baumannii S1 kültürünü 600 nm (OD₆₀₀) 0.8'de istenen optik yoğunluğa ayarlayın. 96 kuyu bir plaka kullanarak, bakteri kültürünü (1:100 seyreltme) 10 μl saflaştırılmış GKL enzimi (40 mg/ml) içeren taze LB içine aşılayın; Yeni kültürün son cildi 100 μl'dir.
3. Ayrıca bir kontrol kültürü de hazırlayın; Bu enzim içermez. İstenilen sayıda çoğaltma elde etmek için benzer koşulları tekrarlayın.
4. Plakayı bir kapağla kapatın ve kapalı 10 L'lik plastik bir kapa koyun. Plakayı 30 °C'de 3 saat boyunca inkübe yapın, ardından ortamı nazikçe çıkarın.
5. Kuyuya 100 μl taze LB ortamı daha ekleyin ve tabağı 30 °C'de 21 saat kuluçka yapın.
6. İkinci kuluçka döneminden sonra tüm ortamı nazikçe çıkarın. Planktonik bakteri hücresini 200 μl steril suyla yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimum rahatsızlık olduğundan emin olun.
7. Her kuyuya 100 μl %1 kristal mor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın. Kuyuyu, 200 μl steril suyla yıkayarak kristal mor çözeltisini çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
8. Her kuyuya 100 μl %33 asetik asit ekleyin ve 15 dakika boyunca hafif çalkalayarak kuluçka yapın; Bu boyayı çözer.
9. 600 nm seviyesinde kristal menekşe emilimini ölçerek oluşan biyofilm miktarını nicelikleştirin. Kristal menekşe miktarı, oluşan biyofilm miktarıyla orantılıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tripton	BD	211705
Maya Ekstraktı	BD	212750
96 kuyu plakası	Yardımcı Oyuncu	3596
Kristal Mor	Sigma-Aldrich	C6158
Asetik Asit	Laboratuvar taraması	PLA00654X	Dikkat: Yanıcı
Synergy HT Microplate Reader	BioTek