1. A. baumannii S1 biyofilminin Konfokal Lazer Taramalı Mikroskopisi
1. A . baumannii S1'in 5 ml kültürünü LB'de 30 °C'de sallama inkubatörde (220 rpm) 16 saat boyunca yetiştirin.
2. A. baumannii S1'in kültürünü istenen OD600 0.8'e ayarlayın. 35 mm cam tabanlı μ-Dish kullanarak, bakteri kültürünü (1:100 seyreltme) taze LB içinde 30 μl saflaştırılmış GKL enzimi (40 mg/ml) içeren taze LB içine aşılayın; Yeni kültürün son hacmi 1 ml'dir.
3. μ-Tabağı bir kapla kapatın ve kapalı 10 L'lik plastik bir kaba yerleştirin. μ Tabağı 30 °C'de 3 saat kuluçka altına alın, ardından ortamı nazikçe çıkarın. 30 μl saflaştırılmış GKL enzimi ve taze ortam ekleyin, toplam hacmi 1 ml elde edersiniz. 30 °C'de 21 saat daha kuluçka yapın.
4. 1.3. adımı tekrarlayın ve μ Tabağı'nı 30 °C'de 24 saat daha kuluçka edin. Sonra, medyayı nazikçe kaldırın.
5. Hank's dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) çözünmüş 500 μl 5 μg/ml Alex Fluo 488-konjuge buğday tohumu agglutinin (WGA) μDish'e ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın; Bu, oluşmuş biyofilmi lekeler. Lekeleme çözelyesini çıkarın ve μ kabı 2 ml HBSS ile yıkayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
6. HBSS'de çözünmüş %3,7 formaldehit 500 μl ekleyip 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın; bu, biyofilmi μ-Dish'e sabitleyecek. μTabağı bir kez 2 ml HBSS ile yıkayın ve ardından çözeltiyi tamamen çıkarın. Biyofilm ile sabitlenen μ-Çanak, CLSM görüntülemeden önce karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
7. CLSM görüntüleme ve analizinde, her görüntü için 0.21 μm aralıkla 97 yığın oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın.
