Polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak ikili kültürde sakkaribakterilerin tespiti

Özet

Kaynak: Collins, A. J. ve diğerleri, Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkaribakterilerin Stabil İkili Kültürlerinin Oluşturulması. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, Aktinomyces ile ikili kültürde Saccharibacteria'ı tespit etmek için Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (PCR) kullanımını göstermektedir. Protokol, stabil bir konak-parazit etkileşimini doğrulamak için DNA amplifikasyonu ve jel elektroforezini belirtir.

Protokol

1. PCR ile Sakkaribakteri enfeksiyonunu Doğrulayın
   1. 5 geçişten sonra, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile enfeksiyonu doğrulayın. Beş geçiş, büyümeyen Saccharibacteria hücrelerinin 25 döngü PCR kullanılarak tespit sınırının ötesine kadar tükenmesini sağlar.
   2. PCR master karışımı hazırlayın. Önerilen bir tarif şöyledir: her gerekli tüp için 12.5 μL 2x PCR tampon, 0.75 μL 10 μM İleri primer (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0.75 μL 10 μM Ters primer (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl_{2, ve 9} μL su. Vortex ile karıştırın.
   3. Aliquot 24 μL master karışımı 0.2 mL PCR tüpüne koyun. PCR reaksiyonuna 1 μL Sakkaribakteri enfekte kültür ekleyin. Tüpü bir termosikleye yerleştirin ve şu protokolü uygulayın: İlk denatürasyon 95 °C'de 5 dakika, 25 döngü 95 °C'de 30 saniye, 60 °C 30 saniye, 72 °C 30 saniye, 72 °C'de 2 dakika son uzatma, ardından 4 °C'de son tutma.
   4. PCR ürünlerini %1 agaroz jeliyle yükleyip çalıştırın. ~600 bazdan oluşan bir bant Saccharibacteria'ın varlığını gösterir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Beyin Kalp İnfuzyon Suyu (kurutulmuş toz)	Becton-Dickinson	211059	Veya hedef organizmalar için uygun diğer büyüme ortamları
Elektroforez Güç Kaynağı	Bio-Rad	1645052
Elektroforez Donanımı	Bio-Rad	1704467
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Termocycler	Eppendorf	950040025	Ya da PCR için eşdeğer termosikl
MgCl₂ çözeltisi 25mM	Promega	A3513
Moleküler Biyoloji sınıfı su	Fisher Scientific	BP2819100
P-1000 mikro pipeti	Gilson	F123601G
PCR tüpleri 0.2 mL	Fisher Scientific	14-230-205
Pipet uçları - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
SYBR Güvenli DNA Jel boyası	ThermoFisher Scientific	S33102
Triptik Soya Suyu (kurutulmuş toz)	Becton-Dickinson	211825	Veya hedef organizmalar için uygun diğer büyüme ortamları