$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOT: Tüm deney boyunca, makrofaj hücreleri %5CO2 zorunlu hava kuluçka aparasında 37 °C'de kuluçka altına alınır ve sadece deneysel manipülasyonlar için kuluçkadan çıkarılır; bu manipülasyonlar Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilir. Listeria monocytogenes bakterileriyle çalışmak, biyolojik güvenlik seviyesi 2 düzenlemelerine uygundur.
1. Hücre Hazırlığı ve Bakteriyel Enfeksiyon (1. ve 2. Günler)
- 1. Gün
- Tohum 2.0 x 107 kemik iliği köklü makrofaj hücreleri (BMDM) 145 mm tabak üzerinde 30 ml BMDM + Pen-Strep ortamında (Tablo 2). Her bakteri suş için analiz edilecek 3 plaka tohum. Gece boyunca 37 °C'de %5CO2 olan bir zorla hava kuluçka içinde kuluçka yapın.
- Vahşi tip (WT) L. monocytogenes suşunun 10 ml beyin kalp infüzyon (BHI) ortamında, standart bir kuluçka makinesinde 30 °C'de gece boyunca bakteriyel kültüre başlayacağın. Kültür tüplerini sallanmadan eğik şekilde yerleştirin.
NOT: Bu büyüme koşulları, flagella genlerinin ifadesini artırır ve bu da etkili enfeksiyonu teşvik eder.
- 2. Gün
- Pen-Strep antibiyotikleri olmadan ısıtılan BMDM ortamı (Tablo 2) ve 37 °C'de fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS).
- Makrofaj monokatmanını 25 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayarak antibiyotikleri çıkarabilirsiniz. 30 ml taze BMDM ortamı ekleyin.
- Gece boyunca 1,5 ml bakteri kültürünü PBS ile 14.000 x g > santrifüjle 1 dakika boyunca yıkayın, süpernatantı atın ve pipetle bakterileri nazikçe 1,5 ml PBS içinde tekrar süstürün. İki kez tekrarlayın.
- Her makrofaj plakasını gece boyunca yıkanmış 0,5 ml vahşi tip L. monocytogenes kültürü ile enfekte edin. Birden fazla plaka kullanıyorsanız, her plakayı 15 dakika arayla enfekte edin. Bu zaman aralığı, enfeksiyon sonunda her plakanın ayrı ayrı toplanmasını sağlar.
NOT: Enfeksiyonun çokluğu (MOI), BHI agar plakalarında enfeksiyon için kullanılan bakteri kültürünün seri seyreltmeleri ve 24 saatlik 37 °C sıcaklıkta inkubasyon sonrası koloni oluşum birimlerinin (CFU) sayılması ile değerlendirilir. 0,5 ml WT L. monocytogenes stüşu 10403S kullanılarak MOI ~ 100 (makrofaj hücresi başına 100 bakteri CFU) elde edilir. Hücre içi büyümede kusurlu bakteriyel mutantlar analiz edilirken, daha yüksek bir MOI göz önünde bulundurulmalıdır. - 37 °C'de 0,5 saatlik kuluçkadan sonra, enfekte hücreleri PBS ile iki kez yıkayarak bağlanmamış bakterileri çıkarabilir ve 30 ml önceden ısıtılmış BMDM ortamı ekleyin. Bağlanmış bakteriler önümüzdeki 0,5 saat içinde içselleştirir.
- Enfeksiyondan 1 saat sonra, ekstraselüler bakterileri öldürmek için 30 μl gentamisin (1:1.000 ile 50 μg/ml nihai konsantrasyona ulaşın) ekleyin.
- Filtre cihazını, vakum çıkış portlu bir sıvı şişesine filtre başlığı yerleştirerek monte edin. Sonra bir filtre başlığına bir filtre (0,45 μm) yerleştirin, ardından bir silindir hunisi ile farklı parçaları metal bir kelepçeyle sabitleyin. Buz gibi soğuk Renaz suyu hazırlayın.
- Enfeksiyondan 6 saat sonra, enfekte hücrelerden bakterileri aşağıdaki şekilde toplayın. Her tabağı ayrı ayrı ele alın.
NOT: Genellikle, L. monocytogenes makrofaj hücrelerinde enfeksiyonun 6 saati boyunca 1-logluk büyüme tamamlar. Daha uzun kuluçkalar makrofajların bakteriyel aşırı büyümesine ve hücre ölümüne yol açarken, daha kısa kuluçka süreleri bakteriyel yüklerin önemli ölçüde azalmasına yol açabilir. MOI ve enfeksiyon süresi, optimal koşullara ulaşmak için değiştirilebilir.- Enfekte hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Makrofaj hücrelerini lizize etmek için 20 ml buz gibi soğuk, RNazsız su ekleyin. Hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri tabaktan hızlı ama dikkatlice kazıyın.
- Lizlenmiş hücreleri 50 ml'lik konik bir tüpte toplayın. 30 saniye girdab. Santrifüj ile 800 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 3 dakika sür.
- Süpernatantı vakum sistemi kullanarak filtre cihazından geçirin. Cimset kullanarak filtreyi yuvarlayıp hızlıca 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Filtrelerle tüpleri sıvı azotla snap-freeze yapın.
- Bir sonraki örnek için filtreleme cihazını, 1.2.7'de açıklandığı gibi yeni bir filtreyle birleştirin.
- Donmuş filtreleri ertesi gün boyunca -80 °C'de sakla. Alternatif olarak, doğrudan nükleik asit ekstraksiyonuna geçin.
Tablo 1: DNaz Reaksiyon Protokolü.
| RNA | 2 μg'ye kadar (maksimum hacim 44 μl) |
| 10x DNaz tamponu | 5 μl |
| RNase-içermeyen su | 50 μl toplam hacme kadar tamamlandı |
| DNAse | 1 μl (1 birim) |
Tablo 2: Medya ve Tampon Tarifleri.
| 1. 500 ml BMDM+Pen-Strep ortamı (Filtre sterilize edilmiş): | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Aracı (DMEM) | 235 ml |
| Fetal sığır serumu (FBS) (30 dakika boyunca 54 °C'de inaktive edildi) | 100 ml |
| Makrofaj koloni uyarıcı faktör veya M-CSF (L-929 koşullu ortam) | 150 ml |
| Glütamine | 5 ml |
| Sodyum piruvat | 5 ml |
| β-Merkaptoetanol | 0.5 ml |
| Penisilin/Streptomisin | 5 ml |
| Toplam | 500 ml |
| 2. 500 ml BMDM (Filtre steril edilmiş): | |
| DMEM | 235 ml |
| FBS (30 dakika 54 °C'de inaktif hale getirildi) | 100 ml |
| M-CSF (L-929 koşullu ortam) | 150 ml |
| Glütamine | 5 ml |
| Sodyum piruvat | 5 ml |
| β-Merkaptoetanol | 0.5 ml |
| Toplam | 500 ml |
| 3. AE tamponu | |
| Sodyum asetat (NaOAc) pH 5.2 | 50 mM |
| Etilen diamintetraasetik asit (EDTA) | 10 mM |
| RNase-içermeyen su | |
| 4. fenol-kloroform-IAA | |
| Fenol | 25 ml |
| Kloroform | 24 ml |
| İzo-amil alkol | 1 ml |
| 5. kloroform-IAA | |
| Kloroform | 24 ml |
| İzo-amil alkol | 1 ml |