Enfekte Fare Makrofajlarından Elde Edilen Listeria monocytogenes'ten RNA Ekstraksiyonu

Özet

Kaynak: Sigal, N. ve diğerleri. Makrofaj Hücrelerinde Hücre İçinde Yetiştirilen Listeria monositogenlerinden RNA Arındırma. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, enfekte fare makrofajlarından izole edilen Listeria monocytogenes'ten RNA çıkarımı göstermektedir. Protokol RNA'yı korur, hücreleri fenol-kloroform ve ısı kullanarak lizler ve RNA'yı santrifüjle ayırır. Tuz ve etanol, soğuk kuluçka ile birleşerek RNA çökelmesini teşvik eder. Ortaya çıkan RNA, konak kaynaklı gen ifadesini yakalar ve bakteriyel virülans ile adaptasyon stratejilerini ortaya koyar.

Protokol

1. Nükleik Asitlerin Ekstraksiyonu

NOT: Tüm manipülasyonları fenol ve klorofom çözeltileriyle bir duman davlumbazında yapın.

1. Her örnek için 400 μl asitlenmiş fenol karışımı olan kloroformun 1:1 karışımı hazırlanır. Ayrı tüpler karıştırın ve ardından ortaya çıkan sulu tabakayı aspirasyon yoluyla çekin. 40 μl %10 SDS ekleyin.
2. Filtre içeren tüpleri soğuk tutmak için buz üzerinde eritin. Her filtre içeren tüpün içine 650 μl asetat-EDTA (AE) tamponu eklenin (50 mM NaOAc pH 5.2, 10 mM EDTA, RNase içermeyen su).
3. Aşağıdaki adımları mümkün olan en hızlı şekilde gerçekleştirin.
   1. Filtreyi içeren tüpü güçlü bir şekilde girdabla çevirin, böylece filtre tüpün çevresine çırpınır ve tampon filtreyi tamamen yıkar. Tüpü her zaman tekrar buz üzerine koyarak soğuk tutun.
      NOT: Bakterileri filtreden tamamen temizlemek için tersli halde tüpü ayrıca vortex yapmak gerekebilir.
   2. Tüm tüpler için tekrarlayın. İşlemin sonunda süspansiyonu kısa sürede (120 x g ile 1 dakika) aşağı söndürmek faydalı olabilir.
4. Bakteri içeren tamponu SDS ve fenol/kloroform karışımını içeren 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüm tüpler için tekrarlayın. Filtreden kalan tampon almak için tüpleri içeren filtreyi tekrar döndürmek gerekebilir (120 x g'de 1 dakika).
5. Tüm 1,5 ml'lik tüpleri çok tüplü bir vortex cihazına yerleştirin ve 10 dakika boyunca tam hızda girdabı yapın.
6. Tüpleri 65 °C ısı bloğunda 10 dakika kuluçka yapın. Santrifüj maksimum hızda (14.000 x g >) 5 dakika sür.
7. Her tüpten yaklaşık 400 μl sulu tabakayı 40 μl 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve %100 ml etanol içeren yeni bir 1,5 ml'lik tüpe aktarın. Her tüpü iyice girdabla girdap yapın.
   NOT: Bu adımda çökeltilmiş pelletin görselleştirilmesini iyileştirmek için glikojen eklenebilir.
8. Örnekleri -80 °C'de 1 saat kuluçka altına alın. Alternatif olarak, örnekleri gece boyunca -20 °C'de kuluçka edin. Sonra, örnekleri maksimum hızda (14.000 x g > 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin.
9. Her tüpten etanolü (üst katman) dikkatlice çekin. Her numuneye 500 μl soğuk 70% etanol ekleyin ve iyice vortex ekleyin. Santrifüj 4 °C'de maksimum hızda 20 dakika boyunca (1 4.000 x g > 1 4.000 x g) kullanın.
10. Her tüpten etanolü dikkatlice çekin. Örnekleri ısıtmadan vakum evaporatörü kullanarak yaklaşık 2 dakika kurutun. Örnekleri aşırı kurutmayın.
11. Her numuneye 25 μl RNase içermeyen su ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. Dikkatlice girdap ve spin-down yapın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Listeria monocytogenes 10403S
H2O, RNA serbest	Termo Bilimsel	10977-015	DEPC ile arıtılmış su kullanılabilir
Fenol doygun pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Kloroform	Fisher	BP1145-1
İzo-amil alkol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
SDS %10	Sigma-Aldrich	L4522
Etanol mutlak	Merck Millipore	1070174000
MF-Millipore filtreleri 45 mm, 0.45 μm	Merck Millipore	HAWP04700
Vortex-Genie 2	Bilimsel Endüstriler	Model G560E
65 °C ısı bloğu	Termo Bilimsel
4 °C masa santrifüj	Eppendorf	5417R
Steril pipetler, 25 ml	Greiner
Falcon tüpleri, 50 ml	Greiner
1.7 ml tüpler, RNase içermeyen	Axygen	MCT-175-C
SpeedVac sistemi	Termo Bilimsel	SPD131DDA