$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Uropatogenik Escherichia coli (UPEC) Bakteriyel Aşı Hazırlığı
- İdrar yolu enfeksiyonlarını hazırlayın89 (İSİU89) inokulum (aşı gününden 72 saat önce başlayın)
- UTI89'u donmuş bir stoktan LB (Luria-Bertani) agar plakasına çizin. 37 °C'de gece boyunca kuluçka yapın. Bir koloni seçin ve 125 ml'lik bir şişede 10 ml LB içine aşılayın. 37 °C'de 24 saat boyunca statik olarak kuluçka yapın.
- 10 μl gece kültürünü, yeni 125 ml'lik bir şişede 10 ml LB'ye aşılayın ve 37 °C'de ek 24 saat daha statik olarak alın.
- 3 ml (strain ve istenen aşı boyutuna göre değişir) steril 1,5 ml tüplere aktarın ve 7.000 x g sıcaklıkta 3 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından pelleti 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) tekrar süspana geçirin ve ikinci kez santrifüj yapın. Bakteri pelletini 1 mL 1x PBS içinde yeniden askıya alın.
- Bakteriyel optik yoğunluğu ölçün ve konsantrasyonu istenen inokulum yoğunluğuna ayarlayın. Kullanılan inokulumun standart konsantrasyonu10-7 bakteridir; ancak bu, çalışmanın tasarımına bağlı olarak değişiklik gösterebilir.
2. Bakteriyel Aşılama
- İş istasyonunu %70 etanol ile temizleyin ve alanı emici kağıtla kaplayın (veya steril bir akış başlığı kullanın).
- Hazırlanan bakteriyel aşıdan 0,9 ml'ye kadar 1 ml Tüberkülin (TB) enjektörüne çekin (hava kabarcıklarını çıkarın). Hazırlanmış steril aşılama iğnesini, 10 (PE10) boyutlu polietilen borularla inokulu içeren enjekte içeren şırıngaya takın, ardından polietilen boruyu steril şekilde kesin.
NOT: İğnenin ucunun üzerinde 1 mm boru bırakın, böylece mesane delinmesini önleyin. - 1 inçlik kare parafilm parçası kesin ve üstüne yaklaşık bir kuruş büyüklüğünde cerrahi kayganlaştırıcı sür.
- Dişi C3H/HeN farelerini bir buharlaştırıcı odasına koyarak (üretici protokolüne uyarak) anestezi yapın ve yine de normal nefes almaya devam edin (1 nefes/saniye).
DIKKAT: İzofluran inhalasyon anestezisidir. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve solumayı en aza indirin. - Fareyi buharlaştırıcıdan çıkarın, sırt üstü bir kağıt havluya koyun ve bacaklarını açın.
- Anestezasyonu sürdürmek için farenin burnunu burun koni (buharlaştırıcıya bağlı bir tüp, bazı buharlaştırıcı ünitelerinde bulunan kontrollü izofluran dozu sağlayan bir tüp) ile kapatın.
- Mesaneyi hafifçe çarptırarak idrar çıkarmayı teşvik edin ve boş bir mesane oluşmasını sağlayın. Periuretral alanı %100 etanol mendil ile silin. Aşı iğnesi/şırıngasını başta cerrahi kayganlaştırıcıya söndürün.
- Her fareyi 50 μl bakteri çözeltisi ile aşılayın; aşılama iğnesini transüretral olarak yaklaşık 12 mm olarak yerleştirin ve şırınganın pistonuna nazikçe bastırarak inokulum mesane içine (10 μl/s) verildi. Aşılama iğnesini fareden çıkarın.
NOT: Aşılamaya başlarken inokulumun üretral açıklıkta anında geri dönmesi, iğnenin yanlış veya eksik yerleştirildiğini gösterir. - Fareyi burun konisinden çıkarın ve kafesine geri koyun. Her fare için 2.3-2.8 numaralı adımları tekrarlayın. Aşı koşullarını/suşlarını değiştirdiğinizde/değiştirirseniz, şırıngayı ve aşı iğnesini onaylı bir keskin kapta atın ve 2.2. adımdan tekrar başlayın.
NOT: Üropatojen organizmalarla aşılama genellikle şiddetli ağrı belirtilerine yol açmaz. Ancak, nadir durumlarda, yüksek dozlarda patojen uygulanması ateşe, yiyecek ve su alımında azalmaya ve anormal davranışlara yol açabilir. Deney boyunca hayvan sağlığı izlenmelidir. Açık ağrı belirtileri fark edilirse, Buprenorfin gibi bir analjezik (deri altına verilen 0,05−0,1 mg/kg) uygulanabilir.
3. Hücre içi bakteriyel topluluklar (IBC) Sayımları
- Mesanesi aseptik olarak çıkar ve silikon tabanlı 6 delikli bir plakada 1x PBS içine yerleştir. Plakalar, silikon elastomer seti kullanılarak hazırlanabilir ve her kuyuya yaklaşık 1 cm silikon dökülür. Mesanesi makasla ikiye bölün.
- Küçük metal pinler kullanarak, mesane lümeninin yukarıya bakması için mesanesi nazikçe açılır. İğneleri, mesane kesilerinin en dış kenarlarına yerleştirdiğinizden emin olun, böylece üroteliumun maksimum miktarı açıkta kalsın.
- Spaydıktan sonra mesaneyi 1x PBS ile bir kez nazikçe yıkayın. 1x PBS'yi pipetle çıkarın. Mesanesi, tüm açılmış mesaneyi kaplayacak kadar %3 paraformaldehit ekleyerek düzeltin.
DIKKAT: Paraformaldehit kanserojendir. Eldiven dahil uygun koruyucu ekipmanlar her zaman takılmalıdır. İmha kurumsal yönergelere uymalıdır. - Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın. Paraformaldehit çözeltisini çıkarın. 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- LacZ yıkama çözeltisi (2 mM MgCl2, %0,01 sodyum deoksikolat ve %0,02 nonidet-p40 1x PBS) ile üç kez, her yıkamada 5 dakika boyunca yıkayın.
- Yıkama çözelyesini çıkarın ve mesaneleri kapatacak kadar LacZ lekesi ekleyin (9,5 ml LacZ yıkama çözeltisi, 0,4 ml 25 mg/ml X-gal ve 0,1 ml 100 mM K-ferrosiyanid/K-ferrisiyanid). Gece boyunca 30 °C'de ışıktan korunarak kuluçka yapın.
- Kuluçka makinesinden yayılmış mesaneleri çıkarın ve IBC'leri gözlemleyin; bu hücreler diseksiyon dürbüniyle görselleştirildiği gibi mavi nokta görünümünde, 40-60X büyütme ile izlenmiştir.
NOT: Bazen bir fare, tüpün üretra altına yerleştirilmeden önce idrara gidebilir. Bu durumda, tekrar idrar toplamaya çalışmadan önce 15-20 dakika bekleyin.