Gen Susturması için Rekombinant Viral Klonlarının Mısır Fidanlarına Agrobakteri Aracılı Teslimatı

Özet

Kaynak: Beernink, B. M. ve diğerleri. Mısır fidanlarının doğrudan agroinaşılanması, rekombinant foxtail mozaik virüsü ve şekerkamışı mozaik virüsü bulaşıcı klonlarla enjeksiyon yapılmasıdır. J. Vis. Exp. (2021)

Bu video, gen susturma için rekombinant viral klonların Agrobacterium aracılı olarak mısır fidanlarına aktarılmasını gösteriyor. Agrobakteriyel enfeksiyon, sistemik viral yayılım ve RNA girişimiyle ilgili fenotipik değişiklikler sürecini özetlemektedir.

Protokol

1. Enjeksiyon
NOT: 4-7 günlük mısır fideleri enjeksiyon için kullanılabilir. Fide büyüme hızı, büyüme koşulları, fotosentetik aktif radyasyon miktarı (yani seradaki PAR oranının büyüme odasına göre daha yüksek) ve genotipi gibi faktörlerden büyük ölçüde etkilenir; bunlar sera koşullarında kontrol edilmesi zor olabilen diğer faktörlerdir. Bitkiler, 2-3 cm boyunda ve yaprak açılmadığında 4 günlük yaşta enjekte edilebilir ve en alt yuvarlak uçlu yaprak genişlediğinde 7 günlük yaşta bile enjekte edilebilir. Bu aşılama yönteminin başarı oranı, bitkiler ekimden 7 gün sonra yaşlandıkça hızla düşer. Enjeksiyon bölgesi, fidelerin yaşı ne olursa olsun aynıdır.

1. Koruyucu gözlük takarak, bakteriyel süspansiyonu fidanlara koleoptiler düğümün 2-3 mm üzerinde 25G x 5/8" iğne ile 1 mL tek kullanımlık şırıngaya takılı enjekte edin.
   NOT: Koleoptiler düğüm, sonunda taç köklerinin oluşacağı yerdir. Bu, tesisin en düşük düğümüdür. Genellikle, düğümün altında ve altında yeşilden beyaza renk değişimi olur. Enjeksiyon yeri meristemin hemen üstündedir. Bu aşamada birkaç fidanı disseksiye, meristemin yerini ve dolayısıyla doğru enjeksiyon yerini görselleştirmeye yardımcı olabilir.
2. Bitkilerin büyüme evresine bağlı olarak, süspansiyon koleoptili doldurana veya girdada görünür hale gelene kadar şırıngaya hafifçe basın. Bu yaklaşık 100-200 μL süspansiyon demek.
   NOT: Fidana süspansiyon enjekte etmek zorsa, enjeksiyon bölgesi çok düşük olabilir. Süspansiyonu enjekte etmek için sadece orta basınç yeterli.
3. Tüm fideleri enjekte edin, her yapı için şırıngaları ve iğneleri değiştirin.

2. Sürekli bitki bakımı

1. Enjekte edilen fideleri 7-8 günlük olduklarında 13 x 13 x 15 cm veya daha büyük saksılara dikleyin.
2. Büyüme koşullarını koruyun (16 saat fotodönem ve haftada bir kez gübreleme).

3. Enfeksiyonun Teyit Edilmesi (Fenotipik olarak)

1. Bitkilerin fenotipik olarak aşıdan (DPI) 14-21 gün sonra puanlanmasıdır. Kontrol genlerinin susturulmasından kaynaklanan lezyonlar ( lezyon 22 mimik ) veya fitoen desaturase yapraklarda kolayca görülebilir ve FoMV semptomlarından farklıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL şırıngalar	Fisher Scientific	14955450	alternatif olarak, BD 309659
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101			Laboratuvar stoklarından T-DNA transfer makineleri olan RifR, GmR ve vir plazmid kodlayan araçları taşır
Gübre			Peters Gübre 15-15-15 Konsantre
Büyük Saksılar	Kordlok	SQL0550	5x5x4" veya daha büyük. Fide dikmek için.
Mısır Altın Bantam Tatlı Mısır Tohumu	American Meadows, Batı Kıyısı Tohumları
Toprak Alt Tabakası	SunGro Bahçıvanlık	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P, mısırın iyi yetiştiği herhangi bir toprak karışımı yeterlidir