Ağızdan Patogenezi İnceleme İçin Bakteriyel-Mantar Çapraz Biyofilmlerin Oluşturulması

Özet

Kaynak: Schlafer, S ve Frost Kristensen, M. Konfokal Mikroskopi kullanarak Çapraz Krallık Biyofilmlerinde Hücre Dışı PH'ın İzlenmesi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu video, Streptococcus mutans ve Candida albicans'ın ağız benzeri koşullarda biyofilmler çapraz yetiştirilişini göstererek bakteriyel-mantar etkileşimlerini modellemekte; böylece mikrobiyal sinerji, glukan aracılı yapışma ve ağızdan patogenezde asidijenik virülans incelenmesini mümkün kılar.

Protokol

Örnek toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Krallıklar arası biyofilmlerin yetiştirilmesi

1. Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 ve Candida albicans (C. albicans) NCPF 3179 kan agar plakalarında aerobik koşullarda 37 °C sıcaklıkta yetiştirilebilir.
2. Her organizmadan tek koloni 5 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) ile doldurulmuş test tüplerine aktarın. Aerobik koşullarda 37 °C'de 18 saat boyunca yetiştirin.
3. Gece kültürlerini 1.200 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst yüzeyi atın, hücreleri fizyolojik tuzlu suyla tekrar askıya alın ve C. albicans (~10⁷ hücre/mL) ve S. mutans (~10⁸ hücre/mL) için OD_{550 nm} 0.5'e ayarlayın. S. mutans süspansiyonunu steril fizyolojik salinle 1:10 oranında seyreltin (~10⁷ hücre/mL).
4. 50 μL steril tükürük çözeltisi mikroskopi için optik alt 96 kuyu plakasının kuyularına pipet yapın. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Kuyular 100 μL steril fizyolojik tuzlu suyla 3 kez yıkayın. Kuyular boşaltın.
5. Her kuyuya 100 μL C. albicans süspansiyonu ekleyin. 37 °C'de 90 dakika kuluçka yapın. Steril fizyolojik salin ile 3 kez yıkayın.
   NOT: Yıkama sırasında kuyuları tamamen boşaltmayın. Aşırı kesme kuvvetlerinden kaçınmak için 20 μL rezervuar bırakın.
6. Her kuyuya 100 μL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (56 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edilmiş) ekleyin. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın. Steril fizyolojik salin ile 3 kez yıkayın. Kuyular boşaldı, geriye 20 μL bir rezervuar bırakıldı.
7. Her kuyuya 100 μL S. mutans süspansiyonu (1.3. adımda hazırlanmış) ekleyin. %5 sakaroz içeren 150 μL BHI ekleyin. 37 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçka yapın. Eski biyofilmler yetiştirirken, ortamı günlük olarak taze BHI ile değiştirin. Krallıklar arası biyofilm büyüme aşamasının sonunda, steril fizyolojik tuzlu suyla 5 kez yıkayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kan agar plakaları	Statens Serum Enstitüsü	677
Beyin kalp infüzyonu	Oksoid	CM1135
Beyin kalp infüzyonu + %5 sukroz	BDH laboratuvar malzemeleri	10274
Candida albicans	Ulusal Patojenik Mantarlar Koleksiyonu	NCPF 3179
Fetal sığır serumu	Gibco Life teknolojileri	10270
GS-6R soğutmalı santrifüj	Beckman	Yok
μ-Plaka 96 Siyah	İbidi	89626
Steril fizyolojik salin	VWR	6404
Streptococcus mutans	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
V-spektrofotometre V-3000PC	VWR	Yok