$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Silikon wafer hazırlama
- Bilgisayar destekli tasarım (CAD; bkz. Malzeme Tablosu) yazılımında mikrofluidik kanalın geometrilerini tasarlayıp şeffaf bir filme bastırarak fotomaske oluşturulur (Şekil 1A).
- Ana kalıbı aşağıdaki adımları izleyerek yumuşak litografi ile (temiz oda koşullarında) üretin.
- Silikon waferi 200 °C'de 2 saat pişirin.
- Waferi bir spin-coater'ın ortasına yerleştirin ve üzerine SU8 3050 fotorezistanı (bkz. Malzemeler Tablosu) dökün. 1.700 rpm'de 40 saniye boyunca spin kaplama ve 10 saniye/100 devir/dakika rampa süresi.
NOT: Spin-kaplama parametreleri, SU8 3050 için hedef kalınlığı 100 μm olacak şekilde ayarlandı. - Spin-kaplama işleminden sonra, silikon levhayı 65 °C'de 600 saniye ve 95 °C'de 2.700 saniye boyunca yumuşak pişirin. Waferi gece boyunca oda sıcaklığında soğutun.
NOT: Gece boyunca soğutma, SU8'in wafere yapışmasını artırır. - Fotomaski (adım 1.1) waferin üzerine yerleştirin ve 250 mJ/cm² pozlama enerjisi ile ve 350 nm dalga boyunda UV ışığına maruz bırakın.
- Maruz kalan alttan sonra, maruz kalan altlığı 65 °C'de 60 saniye ve 95 °C'de 300 saniye pişirin.
- Master kalıbı elde etmek için silikon waferi geliştirin, onu mrDev600 geliştirici ile doldurulmuş bir bedekte daldırarak elde edin ( bkz. Malzemeler Tablosu). Polimerize olmayan direnci yıkamak için beakeri 1.800 saniye nazikçe sallayın. Sonra, silikon wafere izopropanol püskürterek sıçrama yıkama ile hava kurutma işlemi yapın.
- Silikon waferi 200 °C'de 1.800 saniye boyunca sert pişirin.
- Ana kalıbı, 20 μL Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silanın buhar biriktirmesiyle ( bkz. Malzemeler Tablosu) kalıbın yanındaki cam slayta 40 dakika boyunca vakum kuruducu ile yerleştirilerek 100 mbar bir ölçü basıncı oluşturulur.
2. Mikrofluidik cihazın üretimi
NOT: Burada tarif edilen üretim prosedürü, bir mikrofluidik kanala sahip bir mikrofluidik cihaz içindir. Ancak, aynı yöntem, birden fazla mikroakışkan kanalı paralel olarak üretilmiş bir mikrofluidik cihaz üretmek için de uygulanabilir.
- Elastomeri çapraz bağlayıcısıyla 10:1 oranında karıştırın (bkz. Malzemeler Tablosu) ve polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı hazırlanır. Karışımı eşit şekilde karışana ve kapalı hava kabarcıkları nedeniyle opak hale gelene kadar karıştırın.
- Karışımı vakum kurutucuda gazdan çıkararak, hapsolmuş hava kabarcıkları çıkarılana kadar 100 mbar bir gösterge basıncı oluşturulur. Gazdan gazlandırma süresi genellikle 30 dakikadır.
- Ana kalıbı (adım 1) hücre kültürü kabına yerleştirin ( bkz. Malzemeler Tablosu). Ana kalıbın üzerine 20 g PDMS karışımı dökülerek son kalınlığı 5 mm olan kanallar elde edilir.
- Ana kalıbı 70 °C'de 2 saat pişirin.
- Kürlenmiş PDMS'yi mikrofluidik kanalın etrafında (yaklaşık 3 mm mesafede) bir bıçak ile kesin ve ardından ana kalıptan PDMS mikrofluidik kanalını soyun.
- Mikrofluidik kanalların giriş ve çıkışını oluşturmak için, uçlarında (üçgenlerin üstünde, bkz. Şekil 1A) biyopsi deliği (1,5 mm çapında) delikler açın. Basınç sensörünü daha sonra kurmak için giriş üçgeninin ortasına ek bir delik açın.
- Bir cam slaytı ve mikrofluidik kanalı ticari olarak bulunan %1 deterjan çözeltisi ile ( bkz. Malzeme Tablosu) 5 dakika boyunca yıkay, ardından deiyonize suyla durulayın. Daha sonra PDMS mikrofluidik kanalını ve cam slaytı izopropanol ile yıkayın. Sonra tekrar deionize suyla durulayın. PDMS mikrofluidik kanalını ve cam sürgünü 1 bar sıcaklığında sıkıştırılmış hava ile 1 dakika boyunca kurutun.
NOT: PDMS'nin gözenekli yapısı bağlanmanın etkili olması için tamamen kuru olmalıdır. - Cam slaytı ve mikrofluidik kanalı plazma temizleyiciye yerleştirin ( bkz. Malzemeler Tablosu) ve bağlanacak yüzeylerin yukarıya baktığından emin olun. Plazma temizleyicisini açın ve mikrofluidik kanal ile cam sürgülü 1 dakika boyunca saatte 1 SL/h (standart litre) hava akışında hava plazmasıyla işleyin. Mikrofluidik kanalı, temizleyiciden çıkardıktan hemen sonra cam slayta birbirine temas ederek bağlayın.
NOT: İşlenmiş yüzeylere dokunmadığınızdan emin olun, çünkü bu yapışkanlığı etkileyebilir. Birden fazla mikroakışkan kanalı olan bir mikrofluidik cihaz üretirken, mikroakışkan kanalları aynı anda açığa çıkarın ve tek adımda bağlayın. - Bağlanmış mikrofluidik cihazı en az 15 dakika boyunca 80 °C'lik sıcak plakaya koyun.
- Mikrofluidik cihazı deney başlayana kadar temiz bir hücre kültürü kabında saklayın.
3. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması
- Deney başlamadan önce 20 saat boyunca 3 mL besin suyu 3 yetiştirme ortamı (bkz. Malzeme Tablosu) donmuş gliserol stokundan 15 mL'lik kültür tüpünde doğrudan aşılanarak Bacillus subtilis NCIB 3610 popülasyonunu büyütmek. Gece boyunca (16 saat boyunca) 30 °C ve 200 rpm'de sallanma kuluçkasında kuluçka yapın.
- Deneyin başlamasından 4 saat önce, gece kültüründen 3 μL taze kültür ortamında (1:1.000 seyreltme) 15 mL kültür tüpünde 3 μL ekleyerek bir alt kültür oluşturun. Alt kültürü 30 °C'de 200 devirde 3,5-4 saat boyunca sallanan bir kuluçka içinde kuluçka edinerek 600 nm (OD₆₀₀₀) sıcaklığında 0,1 optik yoğunluk elde edinin.
4. Biyofilm büyüme deneyi
- Deneyden 3 saat önce mikroskopun kutu kuluçka cihazını açın, böylece 25 °C sabit bir sıcaklık sağlanır. Şırınga pompasını ve basınç sensörlerini monte edin ( bkz. Malzemeler Tablosu).
- Giriş ve çıkış borusunu mikrofluidik cihaza bağlayın. Boru ile şırınga arasındaki bağlantıyı sağlamak için giriş borusuna doğrudan bir iğne (dış çapı 0,6 mm) yerleştirin.
- Mikrofluidik cihazı, 30 mL deiyonize su ve 30 mL kültür ortamını vakum kurutucuya yerleştirin ve en az 1 saat boyunca gazdan çıkarın. Sonra, kültür ortamını ve deiyonize suyu yavaşça iki ayrı 30 mL şırıngaya çekin.
NOT: Bu adım, kültür ortamıyla yuyulurken kanalda kabarcık oluşumunu önlemek için çok önemlidir. - Mikrofluidik cihazı mikroskopa monte edin ve çıkış borusunu atık konteynerine yerleştirin.
- Deiyonize su ile doldurulmuş şırıngayı mikrofluidik boru üzerinden mikrofluidik kanala bağlayın ve suyu yavaşça basınç sensörü çıkışından çıkana kadar enjekte edin. Basınç sensörünü suyla doldurun ve mikrofluidik kanal ile basınç sensörünü bağlayan tüpten tüm kabarcıkları yıkayın. Basınç sensörünün çıkışını, basınç sensörüne ayrılmış vidalarla kapatın.
NOT: Tarif edilen doldurma prosedürü, mikrofluidik kanalların girişindeki basınç değişikliklerinin hassas şekilde kaydedilmesini sağlar. Birden fazla mikrofluidik kanalla yapılan bir deney yaparken, her kanalı ayrı bir şırıngaya bağlayarak tüm kanallarda eşit akış koşulları sağlanır.
- Mikrofluidik kanalın geri kalanını deiyonize su ile doldurun.
- Kültür ortamı şırıngasına 1.2 μm filtre (bkz. Malzemeler Tablosu) yerleştirin. Sonra su şırıngasını çıkarın ve kültür ortamı şırıngasını giriş mikrofluidik boruya dikkatlice bağlayın. Şırıngayı şırınga pompasına monte edin ve kanalı kültür ortamıyla 2 mL/s akış hızında 1 saat boyunca yuyusun.
NOT: Filtre, yükleme sırasında bakteri hücrelerinin şırıngaya girmesini engeller. Mikrofluidik kanalın kültür ortamıyla yıkaması, gözenekli yapıdaki kalan kabarcıkları temizler. - Deney sırasında şırınga pompasını istenen akış hızına (burada 1 mL/s) ayarlayın ve basınç sensörlerinin basınç okumasını sıfıra ayarlayın.
NOT: Başlangıç basınç okuması sıfıra ayarlandığında, deney sırasında biyofilm gelişimi nedeniyle oluşan basınç farkı yalnızca ölçülür. - Bakteriyel kültüründen 1 mL 0.1 OD₆₀₀ derecesinde 1.5 mL santrifüj şişesine pipet yapın. Bakteri kültürü, çıkış tüpünü santrifüj şişesine yerleştirerek mikrofluidik kanala yükleyin. Tüplerin çıkışından olası hava kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika bekledikten sonra, mikrofluidik kanal bakteriyel kültürle dolana kadar 1 mL/h akış hızında 150 μL bakteriyel çözelti çekilin.
- Kültür ortamı şırınga filtresini dikkatlice çıkarın ve çıkışı atık konteynerine yerleştirin. Bakteri hücreleri, yüzeylerinin gözenekli ortama tutunmasına izin vermek için mikrofluidik kanalda 3 saat boyunca sıfır akış koşullarında bırakın.
NOT: Bakteri hücrelerinin 3 saat boyunca sıfır akış koşullarında bırakılması, kullanılan bakteri suşunun bağlanması ve iyi oksijenli bir bakteri kültürü sağlanması için optimize edilmiştir. Diğer bakteri suşları ise daha fazla veya daha az zaman alabilir. - Deneyi başlatmak için, şırınga pompasını istenen akış hızına (burada 1 mL/s) ayarlayarak akışı başlatın ve basınç okumasını 1 Hz'de başlatın.
- İstenilen zaman aralığında, optik konfigürasyonda ve büyütmede büyüyen biyofilmin görüntülerini alın.
NOT: Mevcut çalışmada, gözenekli ortamın tüm alanını kapsayan 18 pozisyonda parlak alan modunda 4x büyütme ile görüntüler her 6 dakikada bir 24 saat boyunca alınmıştır.
