Bitki Kök Yüzeylerine Bakteriyel Bağlanmanın Mikroskopi Temelli Değerlendirmesi

Abstract

Kaynak: Matthysse, A. G. Laboratuvarda Ölçülen Bitki Yüzeylerine Bakterilerin Yapışması. J. Vis. Exp. (2018).

Bu video, bitki köklerine bakteriyel yapışmanın faz kontrast mikroskopisi kullanılarak değerlendirilmesini göstermektedir. Bakterilerle kuluçka edilen fidelerden alınan kök örnekleri önce serbest bakteri kontrolü için monte edilir. Numuneler daha sonra gevşek şekilde yapışmış bakterileri çıkarmak için yıkanır ve hasarı önlemek için uygun bir örtü ile yeniden monte edilir. Son olarak, kök tüylerine bağlı bakteri sayısı mikroskop altında sayılır.

Protocol

1. Bakterilerin Aşılanması

1. Aşılanacak bakteri sayısını, bakteriyel yapışmayı belirlemek için kullanılacak ölçüme ve kuluçka süresinin uzunluğuna göre belirleyin.
2. 1 günden kısa kuluçka sürelerini içeren mikroskobik çalışmalar için, nispeten çok sayıda bakteri aşılanın. Bir miktar kültür ekleyin ve nihai olarak^10-6 bakteri konsantrasyonu mL'den fazla olur. Daha uzun kuluçka süreleri için bakteriyel aşı boyutunu azaltın.
3. Bakteriyel yapışmanın canlı hücre sayılarıyla ölçüleceği çalışmalar için, mL'de 10³ ila 10⁶ bakteri konsantrasyonuna ulaşmak için kültür miktarı eklenin.
4. Metabolizmalarının kuluçka ortamındaki pH veya oksijen konsantrasyonunu değiştirecek kadar çok bakteri eklemesinden kaçının. pH kağıdı veya elektrot kullanarak pH ölçün. Oksijen konsantrasyonunu bir oksijen elektrodu kullanarak ölçün.
5. Kumda yetiştirilen bitkiler için aşılama üç olası yöntemle yapılır.
   1. Tohumu ekiden önce bakteriyle aşılayın, tohumları yaklaşık^10-6 bakteri/ml suda 1 dakika bekleterek islatın.
   2. Kökü aksenik fideleri çimlendirerek aşılayın. Fide kökü yaklaşık 1 cm uzunluğunda olduğunda, onu batırın veya tüm fidanı 1 dakika boyunca suda^10-6 bakteri süspansiyonuna koyun.
   3. Ekimden önce bakterileri kumla karıştırarak kumu aşılayın, böylece nihai konsantrasyon yaklaşık^10-3 bakteri/mL elde edilir veya ekimden sonra fidanı 10-6 bakteri/mL süspansiyon ile sulayabilirsiniz.

2. Bakterilerin Bitkisel Materyalle Kuluçka Edilmesi

1. Sıvı ortamda kuluçka için, bakterileri bitki materyaliyle steril suda veya sakroz ve mineral tuzlarda veya bitki dokusu kültür ortamında (örneğin Murashige ve Skoog bazal tuz karışımının 1:10 seyreltilmesi veya MS tuzları gibi) kuluçka yapın.
   1. Bakterilerin yapışmadığı bir kap kullanın. Bitki yüzeyini sürekli olarak örtülü tutmaya çalışın; ya suya dalarak ya da hafif bir tahriklemeyle. Yoğun çaltlama yapışmayı engelleyebilir veya bitki yüzeyinden bakterileri uzaklaştırabilir.
   2. Bitki materyalini ışık mikroskobunda farklı zaman aralıklarından sonra gözlemleyerek kuluçkanın ne zaman durdurulacağını ve ölçümler yapılacağını belirleyin. Bir yapışma süresi genellikle değerlidir; etkileşim hızına bağlı olarak her 1 ila 4 saatte veya her gün alınan örnekler alınır.
2. Kumda kuluçka için, 2.1. adımda sıvı ortamda kuluçka için açıklanan aynı hususları uygulayın.

3. Mikroskopi Kullanılarak Yapışma Ölçümü

1. Bakterilerin yüzeylerde kolayca görülmesi için Nomarski veya faz kontrast optikleriyle mikroskobik ölçümler yapın. Ancak, 20X veya daha yüksek büyütme ile herhangi bir parlak alan mikroskobu kullanılabilir.
   1. Bakterilerin rastgele dağılıp dağıldığını veya belirli bölgelerde mi konumlandığını mikroskobik gözlemle değerlendirin. Ayrıca, tek tek mi yoksa küme halinde mi bağlı olduklarını kontrol edin. Yapışma sonrası bakteriyel büyüme veya hapsolmayı işaret eden mikrokolonilerin varlığını arayın. Bakterilerin yüzeyde biyofilm oluşturup oluşturmadığını kontrol edin.
      NOT: Biyofilm, yüzeye bağlı çok sayıda bakteri olup hücre dışı bir matrisle çevrilidir. Yapı düzgün ve tekdüze olabilir ya da daha karmaşık bir mimariye sahip olabilir.
   2. Flüoresan işaretleyici ile etiketlenmiş bakteriler kullanın. Başka bakteriler varsa ve ilgilenilen bakteriler yeşil floresan protein (GFP) gibi floresan etiketle tanımlanmışsa, etiketlenmiş bakterilerin diğer bakteri kümelerinde varlığını belirlemek için floresan mikroskopisi kullanın. GFP için, 490 nm uyarıma ve 520 nm emisyonlu bir filtre kullanın.
      1. Floresan etiketin bakterileri olumsuz etkilemediğinden, hem Nomarski hem de floresan optikleriyle aynı suştan eşit bir vahşi tip bakteri ve etiketlenmiş bakterilerin aksinik malzemeye yapışmasını gözlemleyerek kontrol edin. Floresan ve koyu bakteriler rastgele karışıp eşit sayılarda bulunursa, etiket teste müdahale etmez.
2. Bağlanmış bakteri sayısını belirleyin.
   NOT: Mikroskopta bağlı bakteri sayısını belirlemek çok zordur. Bağlanma düzensiz bitki yüzeylerine yapıldığında, genellikle nicel bir ölçüm elde etmek mümkün değildir. Bu tür ölçümleri yapmak için taramalı elektron mikroskopisi (bu makalede tartışılmamış) kullanılabilir.
   1. Bakteriler bir kök tüyü gibi pürüzsüz bir yüzeye bağlandığında, kök tüyünün kenarına bağlı olan bakteri sayısını bir mm kök tüy uzunluğunda sayın. Ölçüleri karşılaştırırken yaklaşık aynı boyut ve şekile sahip kök tüylerini kullanmaya dikkat edin.
   2. Mikroskoptaki nesnelerin boyutunu belirlemek için, üzerinde ölçülü işaretler bulunan ticari bir slayt kullanın. Bu slaytı deneysel materyal için kullanılan aynı ayarlarda gözlemleyin ve fotoğraflayın, ortaya çıkan görüntüleri fotomikrograflardaki nesnelerin boyutunu belirlemek için kullanın.
3. Örneği mikroskopi için hazırlayın.
   1. Numuneyi yıka. Örneği mikroskop slaytında bir su damlasına veya kuluçka ortamına taşıyın ve doğrudan gözlemleyin.
      NOT: Bu avantaj şu ki, bakteriyel büyüme veya gerçek bakteriyel ölüm olmasaydı, çok fazla serbest bakteri olma olasılığı düşük olur. Serbest bakterilerin yokluğunu, kuluçkanın yapıldığı kapta bakteriyel ölüm veya bakteriyel bağlanma olabileceğine dair bir uyarı işareti olarak alın. Numunenin yıkanmasının etkisi Şekil 1'de gösterilmiştir.
   2. Numuneyi su veya kuluçka ortamında nazikçe yıkayarak sıvı dolu bir şişeye koyup şişeni hafifçe ters çevirin. Sonra örneği mikroskop slaytına taze sıvıda yerleştirerek gözlem yapın.
   3. Numuneyi sıvıya sıradan bir kapak ve mikroskop slaytı kullanarak monte edin.
      1. Eğer numune kalınsa ve kapak kayağının altında bir şişlik oluşacaksa, basın-uygula kapak slipi kullanın. Bu kapak sliplerinin kenarında kauçuk veya plastikten yapılmış bir halka bulunur. Sıvıyı ve numuneyi kapak kuşağındaki kuyuya yerleştirin, sonra sürgü üzerine koyup nazikçe bastırarak kapak sürgüsünü sürgüye kapatın. Ters çevir ve incele.
      2. Alternatif olarak, benzer şekilde bir alg sayma kaydırması ve kapak kayması kullanın. Bu derinliğe sahip slaytların genellikle 20 katından büyük bir objektif mercekle incelenemeyeceğine dikkat edin.

Results

Şekil 1: Bağlı bakteri sayısını belirlemek için örnek hazırlama adımları. Agrobacterium tumefaciens, domates kökü tüylerine (A, B ve C) ve naylon ipliklere (D, E ve F) bağlanır. Yıkamadan suya monte edilen örneklerde hem bağlı bakter...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Işık mikroskobu	herhangi bir	Yok	Faz kontrastı veya Nomarski optikleri faydalıdır; floresan işaretleyiciler kullanılarak yapılan çalışmalar için floresan mikroskobu gereklidir.
Tohumlar	herhangi bir	Yok	Tohum partisi numarasını ve çeşit listesini not alın
Çamaşır suyu	herhangi bir	Yok
Banyo sonikatörü	herhangi bir bilimsel tedarik şirketi	Yok
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Besin agarı	Difco	2001-01-08
Soyton	Difco	24360
Kum	deniz kumu Fisher Scientific	S25
Kum	Sigma-Aldrich	S9887
Konteynerler	Stuewe & Sons, Inc.	Ray-Leach konik tainerleri	Yetiştirmek istediğiniz bitki türüne uygun birçok farklı boyutta mevcuttur
Parafilm	herhangi bir bilimsel tedarik şirketi	Yok
MS tuzları	Sigma-Aldrich	M5524
Sedgwick-rafter sayma hücresi	Hauser Scientific	HS3800
Prob-klips-press-contalı inkubatin odası	Sigma-Aldrich	Z359483
Rifampisin	Sigma-Aldrich	R3501