Kanserli epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyonu sırasında stres granülleri oluşumu

Özet

Kaynak: Vonaesch, P. ve ark., Memeli Hücrelerinin Bakteriyel Meydan Okumasından Sonra Stres Gralüleri Oluşumunun İmmünofloresan Analizi. J. Vis. Exp. (2017)

Bu video, epitel hücrelerinin patojenik bakteri Shigella flexneri ile enfekte edilmesini ve bunun sonucunda oluşan konak hücresel yanıtını göstermektedir. Bakteriyel efektör proteinler, konak translasyonunu bozarak stres granülleri adı verilen zarsız organellerin oluşumunu tetikler; bu organeller hücrenin enfeksiyona adaptif yanıtını yansıtır.

Protokol

1. Bakteri ve Konak Hücrelerin Hazırlanması

1. 12 veya 14 mm cam kapak sliplerini, sırasıyla 24 veya 12 kuyruklu plakalarda, steril cımbızlarla aktarın; her deneysel durumda bir kuyu sayılır. Bunları ultraviyole (UV) işlemle doku kültürü kapüşpüsünde 15 dakika boyunca sterilize edin.
   NOT: Bakteriyel zorluk ve dış streslerle stres granülü (SG) indüksiyonu için kontrol kuyuları ekleyin.
2. 12 mm örtülü 24 kuyulu bir plaka için, örtü kapaklarına 1 x 10^{5 memeli hücresi} (örneğin, HeLa hücreleri) tohum ekleyin; Kaplama kapaklarını steril bir pipet ucuyla bastırın. Hücreler, her hücre tipine uygun kültür ortamında %5_CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de gece boyunca yapışmasına izin verin.
   NOT: Plaka hücreleri, böylece ertesi gün hücrelerin birleşimi %40 - 60 arasında olur.
   1. HeLa hücreleri için, Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) temel olmayan amino asitler (NEAA) ve %10 dekomplementlenmiş fetal buzağı serumu (FCS) ile inkübe yapın. FCS'yi 56 °C su banyosunda 30 dakika ısıtarak ve serumu 15 dakika sonra bir kez karıştırarak dekomplementi yapın.
3. Bakterileri çıkarmak için, steril bir pipet ucu kullanarak -80 °C dondurucuda saklanan bakteriyel gliserol stokundan (%20 gliserol) az miktarda alıp etiketli bir tabağa yerleştirin. Bakteriyi plakanın yaklaşık %10'una yaymak için steril bir halka kullanın. Yeni steril bir halka kullanın ve onu lekeyden geçirerek yarım plaka uzunluğunda 3 paralel çizgi oluşturun. Bu çizgilerden geç, plakanın geri kalanını kapsayacak. O/N plakasını 37 °C'de kuluçka yapın.
   1. Taze çizgili plakadan tek bir bakteri koloni (örneğin, Shigella flexneri) seçin. 1 haftadan eski bakteri kolonileriyle çalışmaktan kaçının.
   2. S. flexneri süzü M90T için, yeni çizgilenmiş triptik soya agar-%0,1 Kongo kırmızı agar plakasından kırmızı bir koloniyi 8 mL Triptik Soya suyu buluşturmasına 15 mL'lik bir tüpte aşılayın; kapağı sıkılaştırın ve 30 °C'de 222 rpm'de O/N sıcaklığında sarsıntı ile inkübe yapın. DIKKAT: Büyük beyaz koloniler kullanmayın çünkü virülans plazmidini kaybetmişler ve enfekte değildirler.

2. Konak Hücrelerin Bakteriyel Mücadelesi

1. Enfeksiyon potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için bakterileri hazırlayın.
   1. S. flexneri için, alt kültür bakterileri 8 mL triptik soya agarına 150 μL O/N kültürü ekleyerek 222 rpm'de 37 °C'de inkübe ile geç üstel faza (~2 saat) inkübe yapar; bu da virülans gen ekspresyonunu teşvik eder ve enfeksiyonu artırır.
      1. Kültür optik yoğunluğu 0.6 ile 0.9 arasında (600 nm ölçülü) olduğunda, 1 mL kültürü 1.5 mL'lik bir tüpe aktarılır. Pellet bakterileri 8.000 x g ile 2 dakika boyunca ve enfeksiyon ortamında (DMEM, FCS yok) OD₆₀₀ = 1 ile tekrar süzülür. Böylece, OD₆₀₀ 0.85 ise, 850 μL'de yeniden süzülür.
         NOT: S. flexneri için, OD₆₀₀ = 1 olduğunda, 8 mL ortamda kültürlendiğinde mL'de 8 x 10⁸ bakteri olur. 20 enfeksiyon çokluğu (MOI) uygundur. Diğer patojenler için, OD₆₀₀ seviyesinde millilitrelik bakteri sayısı ve uygun MOI ampirik olarak belirlenmelidir.
   2. Bakteriyel-konak etkileşimlerini artırmak için bakterileri poli-L-Lizin (PLL) ile kaplayın.
      NOT: S. flexneri'nin PLL tedavisi SG dinamikleri üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Diğer patojenlerin PLL tedavisine uygunlukları değerlendirilmelidir.
      1. Bakterileri PLL ile kaplamak için, 1 mL bakteriyel kültürü 2 dakika boyunca 8.000 x g ile santrifüj yapın ve ardından pelleti fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) 10 μg/mL PLL'de OD₆₀₀ = 1 ile yeniden süzülür.
      2. Bakteriyel çözeltiyi küçük bir tabağa ekleyin, örneğin 12 kuyu içindeki bir kuyuya, RT (~ 20 °C) sıcaklığında hafif bir tabakta çalkalayıcıda hafif bir çalkalama ile 10 dakika kuluçka yapın.
      3. Pellet bakterilerini 8.000 x g ile 2 dakika boyunca geçirin, fazla PLL'yi çıkarın. Pelleti 1 mL PBS ile tekrar askıya alın ve bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, OD₆₀₀ = 1 olan enfeksiyon ortamında tekrar bekletin.
         NOT: Burada, S. flexneri için enfeksiyon ortamı, FCS olmadan 20 mM N-(2-Hidroksietil)piperazin-N'-(2-etansülfonik asit) (HEPES) içeren konak hücre ortamıdır.
2. Hücreleri bakteriyel mücadeleye hazırlayın.
   1. Memeli HeLa hücrelerinden bir emici pompa ile ortamı çıkarın. Hücreleri yıkamak, döndürmek, emiş pompası ile ortamı çıkarmak için 500 μL RT HeLa hücre ortamı ekleyin ve yerine 500 μL oda sıcaklığında (RT) uygun enfeksiyon ortamı (örneğin, FCS olmadan 20 mM HEPES içeren konak hücre ortamı) ekleyin.
   2. NOT: Tüm yıkama adımlarında hızlı çalışın ve hücrelerin kurumasını önlemek için aynı anda yalnızca 4 kaplama işlemenizi unutmayın.
3. Challenge, hücrelerin %20-50'sini enfekte edecek bakterilerle HeLa hücrelerini geliştirdi.
   NOT: Her bakteri türü için uygun zaman ve MOI belirlenmelidir. Genel olarak iyi bir başlangıç, 37 °C'de 30 dakika ve aylık kullanım süresi 10.
   1. S. flexneri için, iki yöntemden birini kullanarak HeLa hücrelerini meydan okunuz (adım 2.3.1.1 veya 2.3.1.2).
      1. PLL ile tedavi edilmeyen bakterileri (20 μL OD₆₀₀ = 1/24 kuyu plaka kuyusu, 500 μL ortamda) hücrelere 10 dakika boyunca 13000 μg boyutunda döndürün.
      2. PLL kaplamalı bakterileri (15 μL OD₆₀₀ = 1/24 kuyu 24 kuyu plaka 500 μL ortamda) RT'de 15 dakika boyunca ekleyin ki bakteriler hücrelere yerleşsin.
   2. Yerleşik bakterilerle hücreleri 30 dakika boyunca 37 °C doku kültürü kuluçka kutusuna yerleştirerek enfeksiyonun oluşmasına izin verin.
      NOT: Kısa süreler için, S. flexneri enfeksiyonunu doku kültürü inkübatöründe değil, 15 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirerek senkronize edin.
4. Hücreleri yıkayarak enfeksiyonu durdurun.
   1. Hücreleri yıkamak ve fazla bakterileri çıkarmak için, ortamı emiş pompa ile çıkarın, 1 mL taze önceden ısıtılmış (37 °C) HeLa kültür ortamı (DMEM, %10 FCS, NEAA) ekleyin. Ortamı karıştırın, çıkarın ve yerine taze medium ekleyin. İki kez tekrarlayın ve hücrelerin üzerinde taze ortam bırakın.
      1. S. flexneri veya diğer hücre içi bakteriler için, HeLa hücreleri ve yıkama enfeksiyonundan sonra, ortamı 50 μg/mL gentamisin içeren standart doku kültürü ortamı ile değiştirerek ekstraselüker bakterileri öldürür ve daha fazla hücre istilasını önler.
         NOT: Ekstrahücre bakteriler için ortama antibiyotik eklemeyin.
5. Bakterileri istenen süre boyunca hücrelerle bir doku kültürü kuluçkasında inkübe edin.
   NOT: S. flexneri için enfeksiyon, hücre tipine bağlı olarak 6 saate kadar sürebilir. HeLa hücreleri için, enfeksiyonun 1,5 - 2 saat ilerlemesine izin verin, ardından SG oluşumunu tetiklemek için dışsal stresler eklenir. Shigella'nın hücreden hücreye yaydığı Caco-2 enfeksiyonları için, dışsal stres eklemeden önce 30 dakika ile 6 saat arasında enfekte edin. Hücreler, bakteriyel enfeksiyon sonucu SG'lerin oluşumunu değerlendirmek için dışsal stres eklemeden bu noktada sabitlenebilir.

3. Stres Granül Oluşumunun Fiksasyonu ve İmmünoflüoresans Analizi

NOT: Kontrol ve deneysel kapak kağıtlarını aynı anda işleyerek sonraki adımlarda görüntü analizini etkileyebilecek boyama farklarını önleyin. Kontrol örnekleri, SG indükleyici tedavi ile ve olmadan enfeksiyon içermemiş, SG indükleyici tedavi olan ve olmayan enfekte örnekleri içerir.

1. Bir emiş pompası kullanarak ortamı tamamen çıkarın ve PBS içinde 0,5 mL RT 4% paraformaldehit (PFA) ekleyerek örnekleri sabitleyin. RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
   DIKKAT: PFA, operatör ve çevre için zararlıdır. Taşıyıcıyı korumak ve kimyasal atıkları bertaraf etmek için uygun önlemler alın.
   NOT: Alternatif olarak, 15 dakika sabitleyip ardından SG belirteçlerinin daha fazla sitoplazmik lokalizasyonunu korumak için 10 dakika önceden soğutulan metanol ile değiştirin.
2. PFA'yı pipetle çıkarın ve sıvıyı uygun bir atık konteynerine atın. Kapak kapakını 1 mL tris-tamponlu tuzlu suyla yıkayın (TBS: 25 mM Tris, pH 7.3; 15 mM sodyum klorür, NaCl). Kapak örtüsünü yıkama sırasında bir tabak silkeleyicide nazikçe sallayarak 2 dakika kuluçka yapın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Shigella flexneri			Çeşitli laboratuvarlardan talep üzerine temin edilebilir
Tripton kazein soya (TCS) suyu	BD Biosciences	211825	Shigella için standart büyüme ortamı, uygulama - bakteriyel büyüme
TCS agar	BD Biosciences	236950	Shigella için standart büyüme agar, uygulama - bakteriyel büyüme
Kongo kırmızısı	SERVA Elektroforez GmbH	27215.01	Virülens plazmidini kaybetmiş Shigella için ayrım aracı, uygulama - bakteriyel büyüme
Poli-L-Lizin (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Bakterileri kaplamak için enfeksiyonu artırmak için faydalı, uygulama - enfeksiyon
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Sitozolik olmayan ekstrasellüler bakterilerin seçici öldürülmesi, uygulama - enfeksiyon
HEPES	Yaşam Teknolojileri	15630-056	pH tamponu, hücreler RT'de kuluçka edildiğinde faydalıdır, uygulama - hücre kültürü
Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM) modeli	Yaşam Teknolojileri	31885	HeLa hücreleri için standart kültür ortamı, uygulama - hücre kültürü
Fetal baldır serumu (FCS)	Biowest	S1810-100	HeLa hücre kültür ortamı için %5 takviye kullanıldı, uygulama - hücre kültürü
Temel olmayan amino asitler (NEAA)	Yaşam Teknolojileri	11140	HeLa hücre kültürü ortamı için 1:100 seyreltme kullanımı, uygulama - hücre kültürü
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Reaktifan seyrelti, uygulama - hücre kültürü
Paraformaldehit (PFA)	Elektron Mikroskopisi Sahneleri	15714	%4 PFA standart hücrelerin fiksasyonu için kullanılır, uygulama - fiksasyon
24-kuyu hücre kültür plakası	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standart doku kültürü plakaları, uygulama - hücre kültürü
12 mm cam kapak kapakları	NeuVitro	1001/12	İmmünofluoresans uygulamalar için hücre kültürü desteği, uygulama - hücre desteği
Forseps	Sigma-Aldrich	81381	Çoğu floroforda iyi çalışan ucuz ve sağlam montaj ortamı, uygulama - montaj