Fare böbrek dokusunda bakteriyel kolonizasyonun floresans görüntülemesi

Özet

Kaynak: Behera, R. K. ve diğerleri. Enfekte dokularda bakteriyel gen düzenlemesini incelemek için floresans tabanlı bir yöntem. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, enfekte fare böbrek dokusunun hazırlanması, DNA'nın boyalanması ve bakteriyel gen ekspresyonunun çift floresan muhabirler kullanılarak tespit edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Kırmızı tüm bakterileri işaretlerken, yeşil enfeksiyona duyarlı hücreleri vurgular.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.

1. Organların toplanması ve doku işleme
   1. Hayvanları ikincil yöntem olarak CO₂ soluması ve servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın ve nekropsi yapın.
   2. Böbrek (sağ) ve diğer hayati organlar (kalp, karaciğer, akciğer, dalak) alın ve %10 [v/v] tamponlu formalin içeren 15 mL polipropilen tüplere aktarın.
   3. Organların karanlıkta, oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca hafifçe sallanarak veya döndürerek sabitlenmesine izin verin, ancak en fazla 48 saat boyunca yapılmamalıdır.
   4. Organları şeffaf doku dondurucu ortama gömüp dokuları -80 °C'de sakla.
   5. Kriyostat kullanarak dokuyu 10 μm kalınlığında dilimlere ayırın.
   6. Bölümleri önceden temizlenmiş, şarjlı cam sürgü üzerinde karanlıkta 20 dakika boyunca kurutun. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama ve örtülü sert montajlı bir ortam uygulayın. Kürlenen kaydırakları gece boyunca oda sıcaklığında kürleyin ve uzun süreli depolama için 4 °C'ye aktarın.
2. Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi ve Görüntü İşleme
   1. Kullanılan floresan muhabire uygun lazerlerle lezyonları bulmak için monte edilmiş slaytları inceleyin. Bu durumda, yeşil (GFP veya yeşil floresan protein), kırmızı (tdTomato) ve mavi (DAPI) floresan sinyalleri kullanılır.
   2. Bireysel hücreleri görselleştirmek için uygun amaç kullanarak görüntüyü elde edin (örneğin, genellikle 20x veya 40x hedefler kullanılır).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57Bl/6 Fare	Charles Nehri	NA
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Zeiss	NA
Kriyostat mikrotomu	Termo Bilimsel	NA
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)	Cellgrow	46-013-CM
Precellys 24 homojenizatörü	Bertin Laboratuvarları	NA
Sub Xero şeffaf doku dondurma ortamı	Mercedes Medical	MER5000
Superfrost Plus mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-550-15
Vectashield Antifade DAPI ile montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1500