Bakterilerde Morfolojik Değişikliklerin Canlı Hücre Floresan Mikroskopisi Kullanılarak Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Brzozowski, R. S. ve diğerleri. Bakterilerde subhücre protein lokalizasyonunu ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri araştırmak için canlı hücre floresan mikroskobi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, bakterilerde gerçek zamanlı morfolojik değişiklikleri görselleştirmek için canlı hücre floresans mikroskopisini göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerçek zamanlı elde etmek için görüntüleme, zaman geçişi ve dekonvolüsyonda kullanılan adımları özetler.

Protokol

1. Görüntüleme

1. Deney günü, mikroskop sistemini açın. Görüntüleme yazılımını başlatın ( bkz. Materyaller Tablosu) masaüstündeki uygun simgeye tıklayarak. Yazılımın başlangıç diyalog kutusundaki Başlangıllaştır seçeneğine (üzerinde mikroskop gösterilmiştir) tıklayarak mikroskobu başlatın. Başlatmadan önce mikroskop kaba ayarıyla objektİFin tamamen aşağı indirildiğinden emin olun.
   NOT: Başlatmadan sonra, başlatma menüsüne ek olarak üç ek diyalog kutusu görünmelidir: resolve3D, veri toplama ve filtre monitörü.
2. Üretici tarafından sağlanan 100x yağ batdırma hedefine 1.517 (kırılma indeksi) bir damla yağ bırakın (Sayısal Açıklık = 1.4, Çalışma Mesafesi = 0.12 mm; bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Görüntülemenin yapıldığı sıcaklığa uygun daldırma yağını seçmek önemlidir.
3. Numuneyi içeren cam alt çanakı metal muhafaza (tabut) içine yükleyin ve nazikçe sahne kelepçesine kaydırın.
4. Kaba ayar düğmesini kullanarak objektifi yukarı kaldırın, yağ çabak camının tabanına temas edene kadar. Okulluk ve ince ayar düğmesini kullanarak örneği netleştirin. Hücreler odakta olduğunda, mikroskop gövdesinin önünde bulunan seçici anahtarı sola kayarak düğmeyi okuldan kamera moduna çevirin.
5. Deneye görüntüleme yazılımını kullanarak başlayın. Resolve3D penceresinde, bir şişe tarafından gösterilen Design/run deneyi simgesini seçin. Tasarla /çalıştır deneyi başlıklı yeni bir diyalog kutusu görünmelidir.
   1. Tasarım ve ardından tasarım/çalıştır deney diyalog kutusundaki bölümleme sekmesini kullanarak Z-yığınlarının sayısını ve örnek kalınlığını ayarlayın.
      NOT: Temsil eden sonuçlar bölümündeki deneyler için, sabit görüntüler için 200 nm aralıkta 17 Z-yığını ve zaman geçişli mikroskopi için 200 nm aralıkta dört Z-yığını kullanıldı.
   2. Örnekteki hücrelerin kalınlığını ölçmek için, resolve3D diyalog kutusundaki yukarı ve aşağı okları kullanarak Z-düzlemini kademeli olarak manuel olarak ayarlayın. Hücrelerin odak dışı olduğu yerleri görüntü alımı için üst ve alt sınırlar olarak işaretleyin. Deneyi çalıştırmadan önce bu bilgileri içe aktarın.
   3. Zaman geçişli görüntüleme sırasında fototoksisiteyi ve foto ağartmayı en aza indirmek için, Z-yığınlarının sayısını azaltın ve görüntü alınımı için hücrelerin orta düzlemini seçin.
6. Tasarım ve kanal sekmesini kullanarak deney için uygun filtre setini seçin ve ardından tasarım/çalıştır deney diyalog kutusunda (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Ayrıca, POL/DIC bilgisi toplamak için bir referans seçin. Resolve3D diyalog kutusundaki uygun seçenekleri seçerek görüntülemeden önce seçilen kanallar için iletim yüzdesi (ışık yoğunluğu) ve pozlama süresini ayarlayın.
      NOT: Deney için dikkate alınmayan bir test görüş alanında, bu ayarları test ederek seçilen parametrelerin zayıf sinyali kaçırmadan veya aşırı doygunluk yapmadan anlamlı floresans verisi elde edip etmediğini tespit edin. Sonra deneysel kurulum için bu parametreleri içe aktarın.
7. Puan listesini resolve3D diyalog kutusundaki Puan listesi butonunu seçerek açın. Yeni bir diyalog kutusu puan listesi başlıklı olarak görünmelidir. Deneyde kullanılacak birkaç görüş alanını mikroskop aşama kontrolleri kullanarak uygun görüş alanlarını bulup nokta listesi diyalog kutusunda işaretleme seçeneğini seçerek işaretleyin.
   NOT: Mikroskop puan listesindeki bir noktaya yeniden odaklandığında her kez bir yedek noktası seçilmelidir. Bu, mikroskobu listedeki uygun noktaya odaklayıp ardından noktayı değiştirme düğmesini seçerek yapılabilir. Yeniden odaklama yaparken analog kaba/ince ayar düğmesine dokunmamak önemlidir; Odağı ayarlamak için sadece yazılımı kullanın.
8. Zaman geçişi parametrelerini önce tasarım , ardından zaman geçişi sekmesini seçerek tasarım/deneyi çalıştırma diyalog kutusunda ayarlayın. Zaman geçişi kutusunu seçin. Zamanlama görüntüleri/toplam zaman açısından uygun zaman geçiş parametrelerini girin.
9. Puan listesinden görüntülenecek noktaları önce tasarım/çalıştır deneyi diyalog kutusundaki puan sekmesini seçerek ayarlayın. Ziyaret noktaları listesi seçeneğini seçin ve tam bir dizisse, metin kutusuna virgül veya tire ile ayrılmış şekilde görüntülenecek noktaları girin.
10. Bir deneye başlamadan önce, tasarım/çalıştır diyalog kutusundaki çalıştırma sekmesini kullanarak dosya adlarını ve dosya konumlarını düzenleyin. Dosya konumu, ayarlar butonu seçilerek, veri klasörünü seçerek ve ardından uygun klasörü seçerek veya yeni bir klasör oluşturarak değiştirilebilir. Dosya adlarını değiştirin, yeni dosya adını resim dosyası adı metin kutusuna girin.
11. Deneye başla diyalog kutusundaki oynat butonunu seçerek deneye başlayın.
    NOT: Zaman geçişi için, deney boyunca DIC ayarıyla her görüş alanında odakları sürekli kontrol edin (gereksiz foto ağartmayı önlemek için) ve hücreler zamanla odaktan çıktığında puan listesindeki bilgileri yeniden odaklayıp güncelleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Fisher Biyoreaktifleri	BP160-100	Moleküler Biyoloji Derecesi - Düşük EEO
FM4-64	Invitrogen	T3166	Mikroskopi
Cam taban çanak	MatTek	P35G-1.5-14-C	Mikroskopi
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Özelleştirilmiş Olympus IX-71 Ters Mikroskop Standı; Özel Aydınlatma Kulesi ve Iletim Işık Aydınlatma Modülü. Hedefler: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X YAĞ (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); 100X Objective için DIC Prism Nomarski; CoolSnap HQ2 kamera; SSI Meclisi 7 renk; Çevresel kontrol odası - opak bir halde.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitörü
SoftWorx	GE		Üretici tarafından sağlanan görüntüleme yazılımı