$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
1. Listeria monocytogenes'in farelere kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla aşılanması ve karaciğer, dalak ve kalp içindeki bakteriyel yükün değerlendirilmesi
NOT: Tüm hayvan çalışmaları, CDC Biyogüvenlik Seviye 2 yönergelerine uygun olarak yürütülmektedir. Fareler genellikle bir hafta önceden sipariş edilir ve kafeste 5 hayvanla birlikte saklanır. Fareler, enjeksiyondan önce dört gün boyunca yeni laboratuvar ortamına alışmalarına izin verilir. Bu deneylerde, 6-8 haftalık dişi İsviçre-Webster fareleri kullanıldı; 5 kişi bariyer ortamında kafese yerleştirildi ve kısıtsız bir diyetle beslendi.
- Kapağı ve yiyecek/su kutularını çıkararak ve kafesi beş dakika boyunca bir ısı lambasının altına koyarak fare kafesi hazırlayın. Bu süreç, kuyruk damarlarının genişlemesine olanak tanır ve enjeksiyonların yapılmasını kolaylaştırır.
- Bir hayvanı çıkarın ve enjeksiyon sırasında hayvanı tutmak için bir koşum (veya ucu kesilmiş şahin tüpüne) yerleştirin.
- Enjeksiyon bölgesini bir alkol pediyle temizleyin ve alkolün buharlaşmasına izin verin. Bu sadece bölgeyi temizlemekle kalmaz, aynı zamanda kuyruk damarını daha da genişletir.
- 27,5 gauge iğneyle donatılmış 1 ml bir şırınga kullanarak, fareye 200 μl istenen kültürü kuyruk damarına nazikçe enjekte edin.
- Enjeksiyon sonucu oluşabilecek kanamayı durdurmak için gazlı bez kullanın ve hayvanı yeni bir kafese yerleştirin.
- Bu işlemi kalan hayvanlar ve suşlar için tekrarlayın. Her kafesteki hayvanları aldıkları suşla etiketlediğinizden emin olun.
- Hayvanları günlük kontrol edin, hasta görünen hayvanları çıkarıp feda edin. Eğer hiçbir hayvan hastalık belirtisi göstermezse, enfeksiyonların 72 saat boyunca devam etmesine izin verin ve ardından tüm hayvanlar feda edilsin.
- Kurban vermek için, tüm solunumlar durana kadar şişelenmiş kaynaktanCO2 anestezi kullanın, ardından hayvanın öldüğünden emin olmak için servikal dislokasyon uygulanır.
- Kurban yaptıktan sonra, hayvanları diseksiyon için doku kültürü kapüşonuna taşıyın.
- Bir diseksiyon bloğu kullanarak, hayvanın her bacağını büyük iğnelerle sabitleyin ve hayvana %70 etanol ile sprey yapın, ta ki doygunlaşana kadar.
- Karın ve göğüs derisini, vajinal açıklıktan xiphoid sürecine kadar uzanan Y şeklinde bir kesi ile kesin, ardından her iki kolun aksillerine kadar ilerlesin.
- Deriyi geri çekin ve her bacaktaki iğneleri çıkarın, böylece diseksiyon açık kalsın.
- Peritoneumu nazikçe keserek bağırsakları, mideyi, karaciğeri ve dalağı açığa çıkar.
- Karaciğerin üst kısmındaki karaciğer venini ve koronal bağı önce keserek karaciğeri çıkarmaya başlayın. Çıkarılması gereken ek bağlar karaciğerin altında bulunur ve bu bağlar ince bağırsağın ilk bölümüne ve sırt kaslarına bağlanır.
- Karaciğeri 5 ml steril ddH20 içine 50 ml şahin tüpüne yerleştirin.
- Sonra, dalağı izole ederek ve damar ile bağları nazikçe keserek çıkarın. Dalak karaciğere göre daha kolay çıkarılır. Dalağı, 5 ml steril ddH20 içeren ayrı bir şahin tüpüne yerleştirin.
- Diyaframı bulun ve göğüs gövdesini hafifçe keserek göğüs hakkını görselleştirebilirsiniz. Xiphoid sürecini ve göğüs kemiğini boyun seviyesine kadar keserek göğüs bölgesini açın, böylece kalp ve akciğerler ortaya çıkar.
- Pens kullanarak, kalbi nazikçe ucundan tutup aort ve akciğer damarları gergin hale getirecek şekilde kaldırın. Bu damarları keserek kalbi serbest bırakın.
- Kalbi, 5 ml steril ddH20 içeren 50 ml bir şahin tüpüne yerleştirin.
- Fare leşini atın ve bu işlemi her hayvan için tekrarlayın; her çıkarılan organ için 5 ml steril ddH20 içeren temiz şahin tüpleri kullanılıyor.
- Tüm organlar çıkarıldıktan sonra çalışma istasyonunu temizleyin ve tezgaha dönün.
- Beş fareden alınan her organ seti için homojenizatorun temizlenmesi ve sterilizasyonu için 5 tüplük bir set hazırlayın (yani 5 karaciğer için bir 5 tüplük set, 5 dalak için 5 tüp, 5 kalp için 5 tüp). Her tüpten dört tane 30 ml steril ddH20 ile doldurulmalı, biri ise 30 ml %90 EtOH ile doldurulmalıdır.
- Bir TissueMaster (veya eşdeğer homojenizer) kullanarak, homojenizörü (çalışırken) 1.21. adımda hazırlanan tüplere aşağıdaki şekilde batırarak probu temizleyin:
- Tüp 1 (ddH2O) Tüp 2'de 5 saniye (ddH2O) Tüp 3'te 5 saniye (EtOH) Tüp 4'te 5 saniye (ddH2O) 5 saniye Tüp 5'te (ddH2O)
- Bir karaciğeri homojenizer ile en az 2 dakika boyunca veya organın görünür kısmı kalana kadar homojenleştirin. Probdan büyük kalıntıları çıkarmak için cımbız kullanın.
- Tarif edilen temizlik sürecini tekrarlayın.
- Diğer karaciğerler için homojenizasyon sürecini tekrarlayın, probu her karaciğer arasında tarif edilen süreçle yıkamaktan emin olun.
- Tüm karaciğerler tamamen homojenleştikten sonra, karaciğer için yıkama tüplerini (1-5) atın.
- Hem dalak hem de kalp için homojeniz/temizleme işlemini tekrarlayın, her organ serisi için yeni bir yıkama tüpü seti kullandığınızdan emin olun. Herhangi bir noktada yıkama borupları bulanık hale gelirse, onları atın ve seri tamamlanmak için yeni tüplerle değiştirin.
- Tüm organlar homojenleştirildikten sonra, homojenizatorda son bir temizlik döngüsü yapın ve depolamak için iyice kurutulun.
- Her organdan yaklaşık 200 μl 96 kuyu bir plakanın ayrı bir kuyusuna yerleştirilin.
- Org örneklerinde seri seyreltmeler yapılarak 1:10 aralığında 1:10,000 seyreltme (karaciğer ve dalak) veya 1:1,000 seyrelme (kalp) kadar seyreltirilebilir.
- Sulandırma serisini önceden ısıtılmış LB agara spot plaka ile yerleştirin. Ayrıca, zayıf kolonileştirilmiş organlardan CFU'yu saymak için her seyreltilmiş organ ve plakadan 20 ul LB agar plakalarına ayrı LB agar plakalarına alın.
- Homojenize organları içeren şahin tüplerini atın ve seyreltme serisini içeren 96 kuyu plakalarını parafilm ile sarıp -80 °C'de dondurucu kutusuna yerleştirin.
- Lekelerin kurumasına izin verin. Bu süreç, plakaların kaputun içine yerleştirilip kapakların çıkarılmasıyla hızlandırılır.
- Lekeler kuruduktan sonra, plakaları gece boyunca 37 °C inkuluçka makinesine yerleştirin.
- Ertesi sabah her noktadaki koloni sayısını sayın ve organ başına toplam bakteri sayısını hesaplamak için seyreltme serisini kullanın.