Fare kalp dokusunda bakteriyel mikrolezyonların mikroskobik görselleştirmesi

Özet

Kaynak: Brown, A. O. ve diğerleri. Streptococcus pneumoniae'nin kardiyak mikrolezyonlar içinde görselleştirilmesi ve ardından kardiyak yeniden şekillendirme. J. Vis. Exp. (2015).

Bu video, fare kalp dokusundaki bakteriyel mikrolezyonların mikroskobik görselleştirilmesini göstermektedir. Streptococcus pneumoniae ile enfekte olan bir farenin kalbi, koronal kesitler için işlemeden önce toplanır, yıkanır ve sabitlenir. Bu bölümler hematoksilin ve eozin ile boyanır ve mikroskob altında incelenir; mikrolezyonlar içinde bulunan bakteriler görselleştirilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.

1. Enfeksiyon

1. 10-12 haftalık yaşlar arasında her iki cinsiyetten BALB/c fareleri alın.
   NOT: Streptococcus pneumoniae serotip 4 süzü TIGR4, dizilmiş virülent bir klinik izolattır.
2. TIGR4'ü Todd-Hewitt çorbasında %5_CO2'de 37 °C'de yetiştirin; optik yoğunluk (OD₎₆₂₀ 0,5 (1,0 x 10⁸ koloni oluşturan birim [CFU]/ml ile karşılık gelir). Pnömokok kültürünü 3.500 x g g'de 10 dakika boyunca santrifüjle pellet edin ve süpernatantı vakum hattıyla çıkarın. Bakterileri steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile askıya alın ve nihai konsantrasyon 1.0 x 10⁴ CFU/ml olarak seyreltirin.
3. Bir indüksiyon odası kullanılarak, fareleri oksijende %2,5 buharlaştırılmış izofluran ile anestezi edin. Anestezi durumunu yumuşak cımbızla nazik bir parmak sıkmasıyla doğrulayın.
   1. Anestezi altındaki fareyi bir elinizle dik tutarak, her fareye peritoneal olarak (i.p.) 100 μl S. pneumoniae süspansiyonu enjekte edilin; bu, 27-30 gauge iğneli bir şırıngaya (1.0 x 10³ CFU challenge dozuna karşılık gelir). Fareyi tekrar kafesine yerleştirin. Fareler genellikle enjeksiyondan 30-40 saniye sonra uyanır.
4. Enfeksiyonun en az 24 (erken) veya 30 (ileri) saat boyunca devam etmesine izin verin.
   1. Fareleri CO₂ asfiksasyonu ile ötenazi yapın. Farenin öldüğünden emin olmak için servikal dislokasyon işlemi yapın. Ötenazi, Step 1.6'da kalbin alınmasıyla daha da doğrulanır.
5. Kuyruğu alkollü bir sürüntüyle dezenfekte edin ve 2-3 mm kesitini kesin. 2 μl kan toplap, kanı 1 U/ml sodyum heparin içeren PBS ile seri olarak 10 kat seyreltmek için beş kez incelendirin. Triptik soya kan agar plakasında seri seyreltmeler yapın ve gece boyunca %5_CO2 içinde 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün koloniden çıkarımlar bakteri seviyesini sayar.
6. Fareyi cerrahi bir platformda sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin. Göğsü %70 etanol ile püskürtün ve kurutulun. Cerrahi makas ve pens kullanarak göğüs boşluğunu açın, kaburga kafesini çıkarın ve diyaframı keserek kalp ile akciğerleri açığa çıkarın. Makasla kalbe bağlı kan damarlarını kesin ve morarmamayı önlemek için kalbi dikkatlice inceleyin.
7. Kalp PBS ile durulayın ve ardından doku örneği toplama kasetlerine yerleştirin, böylece doku kesitleri sırasında koronal kesitler alınsın. Parafin gömü için, kasetleri %10 tamponlu formalin çözeltisine yerleştirin ve ertesi gün parafin gömü için gönderin.
   1. Alternatif olarak, kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir kriyomold içinde optimal kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiği kullanılarak ani dondurma yöntemi uygulanır.

2. Lezyonlar İçindeki Kalp Lezyonları ve Pnömokokların Görselleştirilmesi

1. Parafinle gömülü kalp kesitlerini, her doku bölümünde kalbin 4 odası görünür şekilde kesin. Slaytları 5 μm kalınlıkta kesin.
2. Standart yöntemlerle hematoksilin ve eozin (H&E) ile slaytları deparafikinize ve boyama yapın.
3. H&E boyalı kalp kesitlerini düşük (100X, 200X) ve yüksek (yağ batırma: 400X, 1.000X) büyütmelerde ışık mikroskobu ile görüntüleyin. Kalp mikrolezyonları miyokardda tespit edin. Burada, 100X 1.3 sayısal açıklık Plan-NEOFLUAR objektefiyle donatılmış Zeiss Axioskop 2 mikroskobu kullanılarak H&E görüntüleri alın.
   NOT: Erken evrelerde, kalp lezyonları farklı renk görünümleriyle ve bazı durumlarda bağışıklık hücrelerinin (monositler ve granulositler) varlığıyla ayrım edilir; bunlar monositlere benziyor. İleriye dönmüş lezyonlarda, özellikle 30 saat içinde görülenlerde, bağışıklık hücreleri yoktur ve onların yerine büyük vakuol benzeri lezyonlar gözlemlenir. Bağışıklık hücresi akışının kalp lezyonu gelişiminin erken aşamalarında gerçekleşebileceğini belirtmek önemlidir, ancak bu bir zorunluluk gibi görünmüyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Todd-Hewitt suyu	Neogen	7161A
O.C.T (optimal kesme sıcaklığı) Bileşik	Doku-Tek (Sakura Finetek)	4583
Doku Yapışkan Mikroskop Slaytları	Polysciences, Inc.	24216
Paralube veteriner merhemi	Dechra	12920060
Hematoksilin ve Eozin Boyama Kiti	Belirsiz		Standart