$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, ilgili hayvan etik inceleme komitesi tarafından incelenip onaylanmıştır.
1. Enfeksiyon
- 10-12 haftalık yaşlar arasında her iki cinsiyetten BALB/c fareleri alın.
NOT: Streptococcus pneumoniae serotip 4 suşu TIGR4, dizilenmiş virulent bir klinik izolattır. - TIGR4'ü Todd-Hewitt çorbasında 37 °C'de, %5CO2'de yetiştirin; kültür 620 nm (OD620) optik yoğunluğuna ulaşana kadar 0.5 (1.0 ×10 8 koloni oluşturan birim [CFU]/ml denk gelir). Pnömokok kültürünü 3.500 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjle pellet edin ve süpernatantı vakum hattıyla çıkarın. Bakterileri steril fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) ile askıya alın ve son konsantrasyona 1,0 × 104 CFU/ml kadar seyreltin.
- Bir indüksiyon odası kullanılarak, fareleri oksijende %2,5 buharlaştırılmış izofluran ile anestezi edin. Anestezi durumunu yumuşak cımbızla nazik bir parmak sıkmasıyla doğrulayın.
- Anestezi altındaki fareyi bir eliyle dik tutarak, her fareye intraperitoneal (i.p.) 100 μl S. pneumoniae süspansiyonu enjekte edilir; bu, 27-30 gauge iğneli bir şırınga ile (1.0 × 103 CFU meydan okuma dozuna karşılık). Fareyi tekrar kafesine yerleştirin. Fareler genellikle enjeksiyondan 30-40 saniye sonra uyanır.
- Enfeksiyonun en az 24 (erken) veya 30 (ileri) saat boyunca devam etmesine izin verin.
- Fareleri CO2 boğulmasıyla ötenazi yapın. Farenin öldüğünden emin olmak için servikal dislokasyon işlemi yapın. Ötenazi, Step 1.6'da kalbin alınmasıyla daha da doğrulanır.
- Kuyruğu alkollü bir sürüntüyle dezenfekte edin ve 2-3 mm kesitini kesin. 2 μl kan toplap, kanı 1 U/ml sodyum heparin içeren PBS ile seri olarak 10 kat seyreltmek için beş kez incelendirin. Triptik soya kan agar plakasında seri suyulmaları yaparak gece boyunca %5 CO2'de 37 °C'de kuluçka yapın. Ertesi gün koloniden çıkarımlar bakteri seviyesini sayar.
- Fareyi cerrahi bir platformda sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin. Göğsü %70 etanol ile püskürtün ve kurutulun. Cerrahi makas ve pens kullanarak göğüs boşluğunu açın, kaburga kafesini çıkarın ve diyaframı keserek kalp ile akciğerleri açığa çıkarın. Makasla kalbe bağlı kan damarlarını kesin ve morarmamayı önlemek için kalbi dikkatlice inceleyin.
- Kalp PBS ile durulayın ve ardından doku örneği toplama kasetlerine yerleştirin, böylece doku kesitleri sırasında koronal kesitler alınsın. Parafin gömü için, kasetleri %10 tamponlu formalin çözeltisine yerleştirin ve ertesi gün parafin gömü için gönderin.
- Alternatif olarak, Optimal Kesme Sıcaklığı (O.C.T.) kullanılarak ani dondurma yöntemi uygulanabilir. Kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir kriyomold içindeki bileşik.
2. Lezyonlar İçindeki Kalp Lezyonları ve Pnömokokların Görselleştirilmesi
- Parafinle gömülü kalp kesitlerini, her doku bölümünde kalbin 4 odası görünür şekilde kesin. Slaytları 5 μm kalınlıkta kesin.
- Standart yöntemlerle hematoksilin ve eozin (H&E) ile slaytları deparafikinize ve boyama yapın.
- H&E boyalı kalp kesitlerini düşük (100×, 200×) ve yüksek (yağ batırma: 400×, 1.000×) büyütmelerde ışık mikroskobu ile görüntüleyin. Kalp mikrolezyonları miyokardda tespit edin. Burada, 100× 1.3 sayısal açıklık Plan-NEOFLUAR hedefiyle donatılmış Zeiss Axioskop 2 mikroskobu kullanarak H&E görüntüleri alın.
NOT: Erken evrelerde, kalp lezyonları farklı renk görünümleriyle ve bazı durumlarda monositlere benzeyen bağışıklık hücrelerinin (monositler ve granulositler) varlığıyla ayrım edilir; bunlar monositlere benzeyen gibi görünmektedir. İleriye dönmüş lezyonlarda, özellikle 30 saat içinde görülenlerde, bağışıklık hücreleri yoktur ve onların yerine büyük vakuol benzeri lezyonlar gözlemlenir. Bağışıklık hücresi akışının kalp lezyonu gelişiminin erken aşamalarında gerçekleşebileceğini belirtmek önemlidir, ancak bu bir zorunluluk gibi görünmüyor.
3. Mikrolezyonlar içinde pnömokokklar için immünofluoresan mikroskopi
- Kalbi mikrotomlu kriyokalıplarda 5 μm kalınlıkta kesin ve kesitleri pozitif yüklü cam slaytlara yerleştirin. Donmuş kalp bölümlerinin erimesini ve hava kurumasını bırakın. Bölümleri %10 nötr tamponlu formalinde 10 dakika sabitleyin (pH 6.8-7.2 25 °C'de).
- Slaytları (3×) PBS'de 5 dakika yıka, 15 dakika boyunca %0,2 Triton X-100 PBS'de geçirin, sonra PBS'de tekrar yıkayın.
- Slaytlarda %10 keçi serumu ile PBS ile 1 saat blok doku kesiti yapın.
- PBS ile slaytları durulayın, örtün ve kalp bölümlerini tavşan anti-serotip 4 pnömokok antiserumu ile 1:1.000 derecesinde PBS ile %10 keçi serumu ile 2 saat boyunca 37 °C'de inkubasyon yapın.
NOT: Negatif kontroller için araştırmacılar naif tavşan antiserumu kullanmalıdır - PBS ile yıkandıktan sonra, bölümleri %10 keçi serumu PBS ile kaplayın ve inkübe yapın; keçi anti-tavşan Fluorescein İzotiosiyanat (FITC) konjuge antikoru ile 1:2.000 derecesinde 30 dakika boyunca 37 °C'de kullanılsın.
- Üreticinin talimatına uyarak, ökaryot çekirdeklerinin görselleştirilmesi için 5 mg/ml DAPI (4',6- Diamidino-2-Phenylindol) kullanın. Doku bölümlerini FluorSave ile yıkayıp monte edin.
- Hem düşük hem de yüksek büyütmede konfokal mikroskop sistemi kullanarak floresan görüntüler alın. En iyi sonuçları elde etmek için sayısal diyaframı buna göre ayarlayın. Burada, 60× 1.42 sayısal diyafram hedefli konfokal sistem kullanarak floresan görüntüler elde edin.