Bu video, bakteriyel virülansı değerlendirmek için amoebaları yüzeye bağlı veya planktonik bakterilerle kuluçka altına almak, kalsein-asetoksimetil ester (kalsein-) agaroz pedi uygulamak ve konak hücre hasarını tespit etmek için floresans görüntüleme yöntemi kullanılarak hızlı ve görüntü tabanlı bir yöntem gösterilmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüzeyden Kaynaklanan Bakteriyel Virulansı Taramak İçin Hızlı Görüntü Tabanlı Bir Analiz
246 görüntülenme
⸱
26 Şubat 2026
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Mikroskopi - Agar pedinin hazırlanması
- Amoebalar Pseudomonas aeruginosa ile karıştırılmaya hazır olmadan yaklaşık 30 dakika ile 1 saat arasında agar pedleri hazırlayın.
- Mikrodalgada %1 (w/v) agar, geliştirme tamponunda (DB) 250 mL'lik bir şişede pişirin. Her 20 saniyede bir karıştırın, ta ki agar kümeleri kaybolana kadar.
- Erimiş agarı önceden ısıtılmış 55 °C su banyosuna 15 dakika boyunca koyarak soğutun.
- Konik bir tüpteki erimiş agara 15 μL kalsein-stok çözeltisi ekleyin. Tüpü nazikçe 4-5 kez ters çevirerek karıştırın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
NOT: Bu adımı polipropilen 15 mL santrifüj tüpünde gerçekleştirin. Kalın cam kap kullanmayın, çünkü bu agarın çok hızlı katılaşmasına neden olur. - Erimiş agar karışımını 12 cm x 10 cm ölçülerinde bir cam tabağın üzerine dökün ve agarın oda sıcaklığında 10 dakika katılaşmasına izin verin. Cam plakayı baskılı bir ızgara üzerine yerleştirip metal bir cetvel kullanarak katı agar yastığını 1,5 cm x 1,5 cm boyutlarında daha küçük parçalara kesin.
- Jeli nemli bir kutuda nemli şekilde nemlendirilmiş halde kullanıma hazır hale getirin.
2. Mikroskopi - Görüntüleme için bakteri-amip örneğinin hazırlanması
- Yüzeye bağlı bakteri hücrelerinin virülansını ölçmek için, yüzeye bağlı bakterilere 10 μL amip hücresi ekleyin.
NOT: Bu adım, amiplerin bakterilerle karışmasını tanımlar. - Planktonik hücrelerin virülansını ölçmek için, 10 μL amip hücresi ile 10 μL planktonik bakteri karıştırın.
NOT: Bakterilerle karışmadan önce aksinik olarak yetiştirilmiş amib hücrelerini (OD600 oranı 0.2 ila 0.5) yıkamayın. Antibiyotik-antimikotik çözelti kullanımı nedeniyle amip kültüründe E. coli büyümesi gözlemlenmez. - 1.5. adımdan itibaren 1.5 cm x 1.5 cm kalsein-agar pedini bakteri-amip karışımının üzerine Petri kabı yüzeyine hemen yerleştirin.
NOT: Agar pedini karışımın üzerine hızlı ve akıcı bir hareketle yerleştirin. Pedi yavaşça karışımın üzerine indirmeyin, çünkü bu hareket hücreleri çevreye doğru itme eğiliminde olur ve pedin alt kısmından uzaklaşır. Bu adım, bakteri ve amiplerin eşit şekilde karıştırılmasını, hareketsiz hale getirilmesini ve her iki hücre tipinin aynı düzlemde tutulmasını sağlar. - Fazla sıvıyı agar pedinin etrafındaki kalan sıvıyı nazikçe pipetle çıkararak çıkarın. Petri kabını oda sıcaklığında 20 dakika kurutmaya bırakın.
- Petri kabını bir kapağla kapatın ve immobilize edilmiş amip-bakteri karışımını oda sıcaklığında ek 40 dakika kuluçka edin. 3.1. adıma geçin.
NOT: Tüm örneklerin aynı süre boyunca kuluçka altına alınması önemlidir, çünkü arka plan floresansı zamanla artar. 1 saat kuluçka süresi önerilir. 1 saatten uzun kuluçkalar daha az tekrarlanabilir çünkü amip hücreleri patlamaya başlayabilir.
3. Mikroskopi - Görüntü Alımı
- Parlak alan ve yeşil floresans görüntüleri elde edebilen floresan mikroskobu kullanarak amipleri görüntüleyin. Yeşil floresans için, uyarılma ve emisyon için sırasıyla 474/27 nm ve 525/45 nm olan yeşil floresan protein (GFP) filtreleri kullanın. Amipleri görüntülemek için 10X (≥0.3 sayısal açıklık) bir nesnel kullanın.
NOT: Agardaki kalsein-, ölen amiplerin yeşil floresan kanalında floresansına neden olur. Sağlıklı amipler aksi takdirde floresan değildir. - Faz kontrastı ve GFP kanalları için alım sürelerini ayarlayarak fototoksisiteyi sınırlayın ve görüntü yoğunluklarının dinamik aralığını optimize edin. Gerekirse diferansiyel girişim kontrastı (DIC) faz kontrastını değiştirin.
NOT: Mümkünse faz kontrastı ve GFP floresansı için 100 - 200 ms pozlamalar kullanın. Tüm deney boyunca pozlama ve enstrüman ayarlarını değiştirmeden tutun. Bu, konak öldürme indeksini hesaplamak için kritiktir. - Konak öldürme indeksini hesaplamak için iyi istatistikler elde etmek amacıyla en az 100 amip hücresi için görüntü alın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifler | |||
| Bacto agar, susuz bırakılmış | BD Difco | 214010 | |
| Antibiyotik-Antimikotik (100X) | Yaşam Teknolojileri | 15240062 | Aliquot 1 mL < ve -20 °C'de sakla |
| Kalsein-asetoksimetil ester (kalsein-) | Yaşam Teknolojileri | C34852 | Kalsein Asetoksimetil () |
| Kalsiyum klorür, susuz | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| D-Glukoz | Fisher Chemical | D16500 | Dekstroz |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Folik asit | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Maya ekstraktı | Oksoid | LP0021 | |
| Özel pepton | Oksoid | LP0072 | |
| Potasyum hiroksit | Fisher Chemical | P250 | |
| Potasyum fosfat monobazı | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodyum fosfat dibazik heptahidrat | Fisher Chemical | S373 | |
| B12 vitamini | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Suşlar | |||
| Dictyostelium discoideum | Siryaporn laboratuvarı | Strain AX318 | |
| Escherichia coli | Siryaporn laboratuvarı | Strain B/r17 | |
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn laboratuvarı | PA14 | PA14 suşu19 |
| Pseudomonas aeruginosa ΔlasR | Siryaporn laboratuvarı | AFS20.1 | PA14 türevi suş20 |
| Malzemeler | |||
| 0.22 μm filtre | Millipore | SCGPT01RE | Filtre sterilizasyonu için |
| Konik tüp, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Cam depolama şişeleri | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| Petri kabı, çapı 6 cm | Corning | 351007 | 60 x 15 mm polistiren plakalar |
| Petri kabı, çapı 10 cm | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polistiren plakalar |
| Kapılı plastik kaplar | Ziploc | 2.57E+09 | Kare 3 bardaklı kaplar |
| Cam plakalar | Bio-Rad | 1653308 | Agar pedleri hazırlamak için. Benzer boyutlarda diğer cam plakalar da kullanılabilir. |
| Ahşap çubuklar | Fisher | 23-400-102 | |
| Ekipman | |||
| Tutulma Ti-E mikroskobu | Nikon | MEA53100 | Mikroskop kurulumu |
| 10X Plan Fluor Ph1 Hedef 0.3 NA | Nikon | MRH20101 | Mikroskop kurulumu |
| Floresans uyarılma kaynağı | Lumencor | Sola hafif lokomotifi | Mikroskop kurulumu |
| Floresans filtre seti | Semrock | LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 | Mikroskop kurulumu |
| Orca Flash 4.0 V2 Kamera | Hamamatsu | 77054098 | Mikroskop kurulumu |
| ImageJ | NIH | v. 1.49 | Görüntü analizi için yazılım |
| MATLAB | Mathworks | R2013 | Görüntü analizi için yazılım |
| Yörüngesel sarsıntı kuluçka makinesi | VWR | 89032-092 | 37 °C'de bakteri büyümesi için |
| Platform sarsıcı | Fisher | 13-687-700 | 22 °C'de amiplerin büyümesi için |
| Spektrofotometre | Biochrom | Ultrospec 10 | |
| Tezgah altı soğutmalı kuluçka makinesi | Fisher | 97990E | 22 °C'de amiplerin büyümesi için |
| İzotemp su banyosu | Fisher | 15-462-21Q | 55 °C'ye soğutma ortamı için |
