Yüzeyden Kaynaklanan Bakteriyel Virulansı Taramak İçin Hızlı Görüntü Tabanlı Bir Analiz

Özet

Kaynak: Perinbam, K. ve Siryaporn, A. Amip kullanarak Hızlı Görüntü Tabanlı Bakteriyel Virulans Testi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, bakteriyel virülansı değerlendirmek için amoebaları yüzeye bağlı veya planktonik bakterilerle kuluçka altına almak, kalsein-asetoksimetil ester (kalsein-) agaroz pedi uygulamak ve konak hücre hasarını tespit etmek için floresans görüntüleme yöntemi kullanılarak hızlı ve görüntü tabanlı bir yöntem gösterilmektedir.

Protokol

1. Mikroskopi - Agar pedinin hazırlanması

1. Amoebalar Pseudomonas aeruginosa ile karıştırılmaya hazır olmadan yaklaşık 30 dakika ile 1 saat arasında agar pedleri hazırlayın.
2. Mikrodalgada %1 (w/v) agar, geliştirme tamponunda (DB) 250 mL'lik bir şişede pişirin. Her 20 saniyede bir karıştırın, ta ki agar kümeleri kaybolana kadar.
3. Erimiş agarı önceden ısıtılmış 55 °C su banyosuna 15 dakika boyunca koyarak soğutun.
4. Konik bir tüpteki erimiş agara 15 μL kalsein-stok çözeltisi ekleyin. Tüpü nazikçe 4-5 kez ters çevirerek karıştırın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
   NOT: Bu adımı polipropilen 15 mL santrifüj tüpünde gerçekleştirin. Kalı....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifler
Bacto agar, susuz bırakılmış	BD Difco	214010
Antibiyotik-Antimikotik (100X)	Yaşam Teknolojileri	15240062	Aliquot 1 mL < ve -20 °C'de sakla
Kalsein-asetoksimetil ester (kalsein-)	Yaşam Teknolojileri	C34852	Kalsein Asetoksimetil ()
Kalsiyum klorür, susuz	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glukoz	Fisher Chemical	D16500	Dekstroz
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich	D5879
Folik asit	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M8266
Maya ekstraktı	Oksoid	LP0021
Özel pepton	Oksoid	LP0072
Potasyum hiroksit	Fisher Chemical	P250
Potasyum fosfat monobazı	Sigma-Aldrich	P0662
Sodyum fosfat dibazik heptahidrat	Fisher Chemical	S373
B12 vitamini	Sigma-Aldrich	V2876
Suşlar
Dictyostelium discoideum	Siryaporn laboratuvarı	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn laboratuvarı	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn laboratuvarı	PA14	PA14 suşu19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn laboratuvarı	AFS20.1	PA14 türevi suş20
Malzemeler
0.22 μm filtre	Millipore	SCGPT01RE	Filtre sterilizasyonu için
Konik tüp, 15 mL	Corning	352097
Cam depolama şişeleri	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri kabı, çapı 6 cm	Corning	351007	60 x 15 mm polistiren plakalar
Petri kabı, çapı 10 cm	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polistiren plakalar
Kapılı plastik kaplar	Ziploc	2.57E+09	Kare 3 bardaklı kaplar
Cam plakalar	Bio-Rad	1653308	Agar pedleri hazırlamak için. Benzer boyutlarda diğer cam plakalar da kullanılabilir.
Ahşap çubuklar	Fisher	23-400-102
Ekipman
Tutulma Ti-E mikroskobu	Nikon	MEA53100	Mikroskop kurulumu
10X Plan Fluor Ph1 Hedef 0.3 NA	Nikon	MRH20101	Mikroskop kurulumu
Floresans uyarılma kaynağı	Lumencor	Sola hafif lokomotifi	Mikroskop kurulumu
Floresans filtre seti	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Mikroskop kurulumu
Orca Flash 4.0 V2 Kamera	Hamamatsu	77054098	Mikroskop kurulumu
ImageJ	NIH	v. 1.49	Görüntü analizi için yazılım
MATLAB	Mathworks	R2013	Görüntü analizi için yazılım
Yörüngesel sarsıntı kuluçka makinesi	VWR	89032-092	37 °C'de bakteri büyümesi için
Platform sarsıcı	Fisher	13-687-700	22 °C'de amiplerin büyümesi için
Spektrofotometre	Biochrom	Ultrospec 10
Tezgah altı soğutmalı kuluçka makinesi	Fisher	97990E	22 °C'de amiplerin büyümesi için
İzotemp su banyosu	Fisher	15-462-21Q	55 °C'ye soğutma ortamı için