Fare dalağında bakteriyel yükün enfeksiyon çalışmaları için değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Madenspacher, J. H. ve Fessler, M. B. Farelerde deneysel bakteriyel zatürrenin indüksiyonu ve fenotiplenmesi için invaziv olmayan ve teknik olarak yoğun olmayan bir yöntem. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, enfekte bir farenin dalağındaki bakteri yükünün niceli olarak belirlenmesi ve enfeksiyonun şiddetini değerlendirme sürecini göstermektedir. Homojenize dalak seri olarak seyreltilir ve plakalanarak toplam bakteri yükü belirlenir. Ortaya çıkan veriler, sistemik doku içindeki konak-patojen etkileşimleri hakkında içgörüler sağlar.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Orofarenksten Klebsiella pneumoniae'nin Mouse İntracheal Aspirasyonu

1. Farelerin kuyruk işareti, dövme veya onaylanmış başka bir tanımlayıcı ile benzersiz şekilde tanımlandığından emin olun.
2. İşlemi hızlandırmak için fareleri izoflurandan çıkarmadan önce P200 pipeti kullanarak bakteri dozlama inokulumu oluşturun. En iyi sonuçlar için i.t. aspirasyonda <100 μl hacim kullanarak taşmayı önleyebilirsiniz. Burada, 2000 koloni oluşturan birim (CFU)/50 μl K. pneumoniae kullanılır.
3. Fareleri, izoflüran gazıyla (örneğin, %2 izoflüran ile 1 L/dakika akış hızında) veya kurumsal yönergelere göre şeffaf bir odada anestezi edin. Birlikte anestezi yapacak fare sayısı, deneycinin konfor seviyesine bağlıdır, genellikle 1-2 tane bir kere olur. Derin nefesler göründüğünde ve 2-3 saniye sayılabilirken nefesi gözlemleyin ve anestezi seviyesini doğrulayın. NOT: Uçucu (inhale) anesteziklerin olası karıştırıcı etkileri konusunda endişe varsa, anestezi bunun yerine intraperitoneal ketamin/ksilazin enjeksiyonu ile sağlanabilir. Yukarıda açıklanan yöntemle derin anestezi sadece birkaç dakika sürer. Daha uzun süreli anestezi indüksiyonu durumunda, göz kurumasını önlemek için göz merhemi kullanılmalıdır.
4. Fare anestezi edildikten sonra, eğik bir Plexiglas tahta üzerinde kazıklar arasına gerilmiş lastik bantla çene dişi dişleriyle asılı olarak yarı yatan sırtüstü pozisyona yerleştirin (Şekil 1).
5. Fare dilini hafifçe yana çekin, bir çift küt, çıkıntısız forseps ile ve dozu P200 pipetiyle ağız boşluğuna yerleştirin. Dil veya orofarenkste travma yaratmamak için büyük özen gösterin.
6. Dili geri çekerken, eldivenli parmakla burnu nazikçe kapatarak fare nefes alana kadar kapatın. Fare iki veya daha fazla nefes alana kadar burnu kapatmaya devam edin ve ağız boşluğunda sıvı görünmesin. Burnu kapatmak, farelerin bakteriyi akciğerlere solumasını sağlar, çünkü fareler zorunlu burun solucularıdır.
7. Faresi aşılama tahtasından çıkarın ve kafesine geri döndürün; anesteziden iyileşirken yatak veya kalıntıların burunları kapatmasını önlemek için fare sırt üstü kalın.
8. Tüm fareler dozlandıktan ve anesteziden uyandıktan sonra, ev fareleri sadece K. pneumoniae dozu almış farelerin olduğu bir kabine/odada bulundurun. Enfeksiyon sonrası 48 saati geçiyorsa fareleri, vücut ağırlıkları da dahil olmak üzere, günlük olarak izleyin.
9. Farelerin 48 saati aşmasına izin verirseniz günlük mash ve/veya ek ısı kullanın.

2. Akciğer ve çevresel dokularda bakteriyel yükün belirlenmesi

1. Başlamadan önce: akciğer ve dalak için 900 μl 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) ve kan için 90 μl 1x PBS içeren seyreltme tüpleri hazırlayın. Bakteri kültürü için etiketlenen plakaları oda sıcaklığında koymak; Bu nedenle, doku toplandıktan sonra, homojenleşme ile bakteri büyümesi için kaplama arasındaki zaman en aza indirilir.
   NOT: Aspirasyonla akciğerlerde bakterilerin heterojen birikiminin gerçekleşebileceği için, bireysel farelerin ya toplam hava yolu hücreselliği ya da toplam (iki taraflı) akciğer bakteri yükü analizi için kullanılması önerilir.
2. Kurumsal yönergeler doğrultusunda fareleri ötenazi yapın. Burada, 150 mg/kg sodyum pentobarbital veya eşdeğer bir ticari ötenazi solüsyesi dozu ölümcül enjeksiyon ve ardından kan dışına çıkarma uygulanır; çünkü bu, CO₂ solunması ve servikal dislokasyonun akciğerlerdeki olası komplikasyonlarını önler.
3. Dalağı çıkarın ve 2 ml 1x PBS'ye yerleştirin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Aletleri her doku/fare arasında etanol kullanarak temizlemeye özen gösterin.
4. Dokuyu buz üzerinde homojenleştirin, tercihen her örnek arasında değiştirilebilen tek kullanımlık homojenizatörlerle. Tek kullanımlık homojenizer uçları, deneyler arasında tekrar kullanılmak üzere otoklavlanabilir.
5. Doku homojenleştikten sonra, seri seyreltme ve plaka yapın. Belirli bir doku/seyreltme plaka örnekleri, plastik üzerinde bir bölme çizgisi çizerek tek bir triptik soya agar (TSA) plakasında ikili olarak yapılır. Kaplama ve seyreltme önerileri aşağıda gösterilmiştir (tüm durumlarda 10 μl numune plakaya yayılır) ve enfeksiyon sonrası 24 saatlik nekropsi temelindedir. 48-72 saatlik örnekler analiz edilirse, sonraki zaman noktalarında artan bakteri yükü nedeniyle daha fazla sayıda seyreltme kaplaması gerekebilir
   1. Dalak için - 100 μl homojenize dalak ekleyerek 100 μl homojenizlenmiş dalak ekleyerek seri olarak 900 μl steril 1x PBS ile seyreltin. Plaka düzgün homojen ve her iki seyreltme de ikili olarak hazırlanır.
6. Yayılma örneklerinin kısa bir süreliğine kurumasına izin verin.
7. TSA plakalarını ters çevirin ve gece boyunca statik 37 °C kuluçka makinesine yerleştirin.
8. Kolonizasyon yapan bakteri sayısını, plakanın her iki tarafından ve her seyreltmeden bakteri kolonilerinin ortalamasını alarak belirleyin. Akciğer için 5 ml ve dalak için 2 ml ilk seyreltmeleri hesaba katarak toplam doku CFU'larını belirleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Farelerde aspirasyon zatürresi için prosedür kurulu. Çalışma fareleri, başı yukarı ve sırtı üzerine (yani yarı yatmış) konumlandırılır, kesici dişler tarafından iki çiğin arasında gerilmiş lastik bantla Plexiglas veya be...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ATCC	43816
Becton Dickenson	211825
Kendi içinde hazırlandı	N/a	Distile su (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na₂HPO₄ (5,75 g), KH₂PO₄ (1 g)