Enfekte Farelerin Bağırsak Dokularındaki Amino Asit Metabolitlerinin Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Specker, J. T. ve diğerleri. Mikrobiyal İşbirliğinin Görüntüleme, Kütle Spektrometrisi Yoluyla İncelenmesi, Enfeksiyon sırasında Agar ve dokuda yetişen bakteri kolonilerinin analizi. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, Clostridioides difficile ile enfekte olmuş farelerin bağırsak dokularındaki amino asit dağılımını, tek başına veya Enterococcus faecalis ile birlikte görselleştirmek için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisinin kullanımını göstermektedir. Bu işlem, doku hazırlığı, matris uygulaması, lazer iyonizasyonu ve mekansal iyon görüntüleri oluşturmak için amino asit iyonların tespitini içerir. Sonuçlar, E. faecalis'in bağırsak ortamını değiştirerek ornitin salgılayarak arginini azalttığını ve böylece C. difficile patogenezini artırdığını ortaya koymaktadır.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Enfekte olmayan kontrol ve C. difficile enfekte fare çek dokularının hazırlanması ve sevkiyatı
   1. 4-8 haftalık C57BL/6 erkek fareleri antibiyotiklerle (0,5 mg/mL sefoperazon veya 0,5 mg/mL sefoperazon + 1 mg/mL vankomisin) 5 gün boyunca içme suyunda tam olarak aşılayın, ardından 2 günlük iyileşme dönemi ve ardından enfeksiyon alın.
   2. Hayvanları CO₂ asfiksiyle ötanazi edin ve fare cecum organını hemen alın. Damıtılmış suya %20 optimal kesme sıcaklığı (OCT) karışımına gömül.
   3. Örnekleri kuru buz üzerine yerleştirip ardından paketleyip analiz için gönderir; analiz edene kadar -80 °C'de saklanın.

 

2. Enfekte olmayan kontrol ve C. difficile enfekte fare cecal dokularının kriyobölümlenmesi

1. Tüm kriyoseksiyon ekipmanlarını %100 etanol ile durulayarak temizleyin ve numuneleri kriyostat odasına yerleştirmeden önce kurumasına izin verin. ITO kaplı mikroskop slaytlarını, iletken kaplama ile slaytın tarafını tanımlamak için ohmmetre kullanarak hazırlayın. Mikroskop slaytının ITO kaplı tarafını oymak ve etiketlemek için elmas uçlu bir yazıcı kullanın.
   NOT: Eldivenler, laboratuvar gözlüğü, laboratuvar önlüğü ve kriyost kolları gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.
2. Bir araştırma kriyomikrotomu üzerinde kriyoseksiyon yapın. OCT'ye gömülü fare ceca dokularını -80 °C dondurucudan kuru buz üzerinde kriyomikrotom odasına (30 °C oda sıcaklığı, -28 °C nesne sıcaklığı) aktarın. Karşılaştırılacak doku örneklerini, görüntüleme kütle spektrometrisi (örneğin, enfekte olmayan kontrol ve C. difficile enfekte olmuş) kullanılarak aynı mikroskop slaytına monte edin; böylece her iki doku tipinin de aynı örnek hazırlanması sağlanır ve doğru metabolit karşılaştırmaları sağlanır.
3. Kriyomikrotom odasının içinde, OCT'ye gömülü dokuyu ek bir OCT çözeltisi kullanarak örnek bir çuk üzerine monte edin. OCT çözeltisi katılaştıktan sonra, chuck'u numune başına sabitleyin. Kriyoseksiyona 10-50 μm aralıklarla başlayın, organın istenen doku derinliğine/düzlemine ulaşın.
4. Doku kesitinin optimal kesitine ulaşıldığında, 12 μm kalınlığında kesitler toplanmaya başlanın. Dilimi sanatçı fırçalarıyla nazikçe manipüle edin ve teflon kaplı mikroskop slaytına yerleştirin.
5. ITO kaplamalı mikroskop slaytını doku kesitinin üzerine yuvarlayarak teflon kaplamalı slayttan dokuyu alın. Doku bölümünü mikroskop slaytına avuç içi ito kaplı slaytın arkasına bastırarak eritim. Doku bölümü şeffaf bir dokudan opak/mat bir dokuya geçene kadar montajı çözmeye devam edin.
6. Kuru buz üzerindeki doku üzerine monte edilmiş mikroskop slaytlarını aynı gün analiz için saklamak üzere kuru kutuya ve kuruducu kutusuna aktarın veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın.

3. Matriks uygulaması ve MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi için enfekte olmayan kontrol ve C. difficile enfekte fare çekal dokularının hazırlanması

1. MALDI matris uygulaması yapın (30 °C nozul sıcaklığı, sekiz geçiş, 0,1 mL/dakika akış hızı, CC deseni, 0 s kuruma süresi, 10 psi).
2. MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi yapın
3. Birden fazla biyolojik kopyadan alınan iyon görüntülerini analiz edin ve yukarıda referans verilen SCiLS istatistiksel yazılımını kullanarak yoğunluk kutusu grafik karşılaştırmalarıyla sonuçları önemlilik açısından karşılaştırın.
   NOT: Uygun istatistiksel testler ve karşılaştırmalar uygulamaya bağlı olacak ve ayırt edici ve korelasyonlu spektral özelliklerin belirlenmesi için mekânsal segmentasyon, sınıflandırma modelleri ve karşılaştırmalı analizleri içerebilir. Karşılaştırmalı analizler, önemli özelliklere p-değerleri atanmayı, doku karşılaştırmaları için ana bileşen analizleri oluşturmayı ve varyasyonları belirlemek için kutu grafiklerini görselleştirmeyi içerebilir. Ayrıca, görüntüleme kütle spektrometrisi sonrası , hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanmış doku kesitinin parlak alan mikroskopisiyle görselleştirilmesi de faydalıdır. Bu, dokudaki morfolojik özelliklerin net tanımlanmasını sağlar ve eğitimli bir patologla danışmanlık yoluyla analiz edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.2 μm Titan3 naylon şırınga filtreleri	Termo Bilimsel	42225-NN
1,5-diaminonaftalin MALDI matrisi	Sigma Aldrich	2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock şırıngaları	Henke Sasss Kurt	4200.000V0
275i serisi konveksiyon vakum ölçeri	Kurt J. Lesker şirketi	KJL275807LL
Smartbeam II Nd:YAG MALDI lazer sistemi (2 kHz, 355 nm) ile donatılmış 7T solariX FTICR kütle spektrometresi	Bruker Daltonics
HPLC için uygun olan asetik asit çözeltisi	Sigma Aldrich	64-19-7
Asetonitril, HPLC için uygun, gradyan derecesi, ≥99,9%	Sigma Aldrich	75-05-8
Amonyum hidroksit çözeltisi, %28 NH3 H2O, ≥99,99% iz metal bazı	Sigma Aldrich	1336-21-6
Otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbaları: 55 gal	Grainger	45TV10
Biyolojik tehlike örnek taşıma torbaları (8 x 8 inç.)	Fisher Scientific	01-800-07
Beyin kalp infüzyon suyu	BD Biosciences	90003-040
C57BL/6 erkek fare	Jackson Laboratuvarları
CanoScan 9000F Mark II fotoğraf ve belge tarayıcı	Kanon
CM 3050S araştırma kriyomikrotomu	Leica Biosystems
Kurutucu kabin	Sigma Aldrich	Z268135
Elmas uçlu yazıcı, Elektron Mikroskopi Bilimleri	Fisher Scientific	50-254-51
Drierit kurutucu pelletler	Drierit	21005
Etanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
flexImaging yazılımı	Bruker Daltonics
ftmsControl yazılımı	Bruker Daltonics
Cam vakum kapanı	Sigma Aldrich	Z549460
HTX M5 TM robotik püskürtücü	HTX Teknolojileri
İndium Kalay Oksit (ITO) kaplı mikroskop slaytları	Delta Teknolojileri	CG-81IN-S115
Hatlı HEPA filtresinden vakum pompasına	LABCONCO	7386500
Metanol, HPLC Derecesi	Fisher Chemical	67-56-1
MTP sürgü-adaptörü II	Bruker Daltonics	235380
Optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği	Fischer Scientific	23-730-571
Peridox RTU sporisit, dezenfektan ve temizleyici	CONTEC	CR85335
PTFE (Teflon) baskılı slaytlar, Elektron Mikroskopi Bilimleri	VWR	100488-874
Döner kanatlı vakum pompası RV8	Edwards	A65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Tek Kullanımlık Yüksek Profilli Mikrotom Bıçakları	Elektron Mikroskopi Bilimleri	63068-HP
Şeffaf vakum boru	Cole Palmer	EW-06414-30
Ultragrad 19 vakum pompa yağı	Edwards	H11025011
Değişken voltajlı transformatör	Powerstat
HPLC için uygun su.	Sigma Aldrich	7732-18-5
Geniş ağızlı dewar şişesi	Sigma Aldrich	Z120790