$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Küçük Molekül İnhibörü Pellikul ve Biyofilm Koloni Oluşumuna Etkisinin Değerlendirilmesi
- Kalsiyum klorür ve demir(III) klorür heksahidrat içermeden, tanımlanmış biyofilm indükleyen MSgg (monosodyum glutamat-gliserol) ortamından oluşan 2x çözelti hazırlayın. Filtre sterilizasyonundan sonra kalsiyum klorür ekleyin. Medium doğrudan kullanıma hazırdır veya karanlıkta 4 °C'de saklanabilir.
- Deney günü 1x MSgg seyreltmesini hazırlayın.
- 2x MSgg ortamını steril damıtılmış su (pelliküller) veya steril %3 sıcak (80 °C) agar (biyofilmler) ile 1 katına kadar seyreldin ve demir (III) klorür heksahidratı son konsantrasyona 50 μM (pelliküller) veya 250 μM (biyofilmler) ekleyin. İstenilen konsantrasyona antibiyotik veya küçük moleküllü inhibitörler ekleyin ve iyi karıştırın. Örneğin, pelliküller veya biyofilmler oluşturmak için 30 ml'de 0,5 mM D-lösin nihai konsantrasyon elde etmek için, 76,3 mM (10 mg/ml) D-lösin stok çözeltisi 196,6 μl eklenin.
NOT: Son 1x MSgg kompozisyonu Tablo 1'de açıklanmıştır. Orijinal tarife kıyasla, ortamda 50 μg/ml treonin bulunuyordu ve katı MSgg ortamında biyofilm koloni yetiştirmek için demir konsantrasyonu, kırışık koloni morfolojisini optimize etmek için 2,5 kat artırıldı.
- Agarın katılaşmasından sonra, katı MSgg plakalarını aşılamadan önce biyolojik bir kapüşonda 30-45 dakika kurutun.
- Pellikul oluşum mekanizmalarına müdahale eden spesifik inhibitörleri seçmek için (Şekil 1), kullanılan konsantrasyonların planktonik ve statik büyümeyi etkilediğini ekarte edin.
- Planktonik büyümeyi (sıvı kültürde zaman içinde optik yoğunluğun zamanla artması) sabit bir büyüme eğrisinde belirleyin; sabit büyüme aşamasına kadar her saat 600 nm optik yoğunluk ölçülür.
- Ölçülen kültür bulanıklığının canlı hücre sayılarını temsil ettiğini doğrulamak için, planktonik büyüme fazında sarsıntı kültüründen birkaç zaman noktasında hücre koloni oluşum birimleri (CFU) sayısını belirleyin.
- Küçük molekül inhibitörlerinin statik pellikul büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, 24 kuyruklu bir hücre kültür kuyusundan 23 °C'de 3 günlük kuluçkanın sonunda hücreler alın, 1.7-1.9. bölümlerde açıklanan aynı koşullar altında aşılanmış ve CFU'yu belirlesin. Bu kontrol için, ekstrasellüler matris bileşenlerini kodlayan operonları (yani B. subtilis ΔepsH, ΔtasA) içermeyen pellikul eksikliği olan bir suş kullanın.
NOT: Bu suş statik koşullarda büyüyebiliyor, ancak pellicle oluşturan yabani tipin aksine, sıvı-hava arayüzüne yüzme yeteneği açısından eksiktir; burada büyüme artan oksijen seviyeleri nedeniyle daha avantajlıdır. Bu nedenle, bu ekstraselüler matriks ve pellikul eksikliği olan suş, statik koşullarda büyümeyi değerlendirmek için önerilen bir referans suşturdur.
NOT: Aşağıda tanımlanan kanonik olmayan D-amino asit D-lösin örneği için, pellicle oluşumunu engelleyen konsantrasyonlarda planktonik ve statik büyüme üzerindeki etkisi dışlandı. Planktonik ve statik büyümeyi belirleme yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- B . subtilis'i -80 °C stoktan (%20 gliserolde dondurulmuş 109 hücre/ml LB kültüründen) çıkararak, steril uç veya aplikatör çubuğu ile LB-%1,5 agar plakasında tek kolonileri izole edin.
- 30 °C'de gece boyunca büyür.
- KRITIK ADIM: Kanonik olmayan D-amino asitler (örneğin D-lösin gibi) tarafından sağlam bir pellikul inhibisyonu için, LB-%1,5 agar plakasından 37 °C'de 37 °C'de 4 saat boyunca sallanma inkübatöründe (sallanma hızı 200 rpm) tek bir koloni yetiştirin. Aşılamadan önce, LB çorbasını, 1.5 ml başlangıç kültürünü 6.000 x g g'de 4 dakika santrifüjlenerek ve süpernatantı dikkatlice çıkararak ve pelleti 1.5 ml MSgg ortamında yeniden süspansiyona geçirerek aşılamadan önce biyofilm indükleyen MSgg ortamıyla değiştirin. Kültürün geri kalanı ise atılabilir. Önemli: Sistemin dayanıklılığını sağlamak için, yıkanmış başlangıç kültürünün 600 nm (OD600) optik yoğunluğu 0.6 ile 1 arasında olmalıdır.
- Başlangıç kültürünün büyütülmesi sırasında, küçük molekül inhibitörü (örneğin, 0.3, 0.5, 1 mM D-lösin) konsantrasyon aralığı olmadan veya içinde 3 ml MSgg ortamı içeren 12 kuyruklu hücre kültürü çoklu tabağı hazırlanır. Kenar etkilerini dışlamak için, farklı konsantrasyonların konumunu çoklu tabak boyunca dağıtın. Alternatif olarak, 1,5 ml MSgg ortamı içeren 24 delikli hücre kültürü çok tabak plakaları kullanın.
- 12 kuyruklu hücre kültürü çok çeşitli plakanın kuyularını 3 μl yıkanmış başlangıç kültürü (1:1.000 sulandırma) ile aşılayın.
NOT: Daha düşük bir seyreltme oranı olan 1:500 kullanılabilir. Bu durum, pelliküllerin gelişim süresini azaltır. - Pellicle'leri 23 °C'de statik koşullarda üç gün boyunca yetiştirin. Bu süre zarfında pellikülleri hareket ettirmeyin, çünkü bu, pellikülün nihai yüzey morfolojisini etkileyebilir.
- Dürbünle ve homojen bir şimşek pozlamasıyla fotoğraflar alın. Alternatif olarak, pellicles'in fotoğrafını yüksek çözünürlüklü bir kamerayla çekin. Tutarsız ışık açıları ve gölgelerden kaynaklanan artefaktlardan kaçınmak için, kamerayı tripoda sabitlemiş şekilde üstten aşağı fotoğraflar çekin ve her iki taraftan 45° bucaklı yumuşak ve büyük bir ışık kaynağı kullanın.
NOT: B. subtilis çok hücreliliğini incelemek için alternatif bir yöntem, katı biyofilm indükleyen MSgg ortamında yapılan biyofilm koloni testidir. Peliküller gibi, bu test de mekânsal zamansal süreçlerin incelenmesine olanak tanır. Küçük molekül inhibitörlerinin aktif aralığı belirlendikten sonra, biyofilm koloni oluşumu üzerindeki etkileri incelenebilir. - Biyofilm kolonilerini büyütmek için, kurutulmuş MSgg %1,5 agar plakasında (Adım 1.7) simetrik olarak 1,5 μl pre-kültür (Adım 1,7) bir şablon yardımıyla — 8,5 cm çapında Petri kabı başına 4 damla. Damlaların tabaktan emilmesine izin verin, sonra hareket ettirin.
NOT: Şablon, hücrelerin yetiştirildiği alanda biyofilm kolonilerinin eşit dağılımını sağlamaya yardımcı olur. Şablonu hazırlamak için, orijinal ölçeklerde toplam büyüme alanını çizin, eşit sektörlere ayırın ve merkezi işaretleyin. 8,5 cm çapında yuvarlak bir Petri kabı için, bu bir biyofilm kolonisine 14 cm2 atanır. - Plakaları 30 °C'de üç gün boyunca kuluçka edin. Bu süre zarfında biyofilm kolonileri gelişir ve üç boyutlu, buruşuk bir yapı oluşturur.
- Adım 1.11'deki gibi fotoğraf çek.
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan son 1x MSgg kompozisyonu.
| 1.925 mM | Potasyum fosfat monobazı |
| 3.075 mM | Potasyum fosfat dibazi |
| 100 mM | 3-(N-morfolino)propansülfonik asit, pH 7.1 |
| 2 mM | Magnezyum klorür heksahidrat |
| 700 μM | Kalsiyum klorür susuz |
| 50μM a | Demir(III) klorür heksahidrat |
| 125 μMb |
| 1 μM | Çinkoklorür susuz |
| 2 μM | Tiamin hidroklorür |
| 50 μg/ml | Triptofan |
| 50 μg/ml | Fenilalanin |
| 50 μg/ml | Treonin |
| %0,5 (v/v) | Gliserol ansutiz |
| %0,5 (v/v) | L-glutamik asit monosodyum tuzu hidrat |
| pellicle testi için a; Bbiyofilm testi için |
