Biyofilm Matris Bütünlüğünü Değerlendirmek İçin Etanol Direnç Testi

Özet

Kaynak: Bucher, T. ve diğerleri. B. subtilis biyofilmlerini, küçük molekül biyofilm inhibitörlerinin karakterizasyonu için bir model olarak inceleme metodolojileri. J. Vis. Exp. (2016).

Bu video, biyofilm matris bütünlüğünün, tedavi edilmemiş ve inhibitör bozmuş biyofilmlerdeki koloni oluşturan birimleri karşılaştırarak bakterilerin etanole karşı direncini nasıl etkilediğini göstermektedir. İnhibörü ile tedavi edilen örneklerdeki azaltılmış CFU'lar, ekstrahücre matriksinin biyofilm gömülü hücreleri antimikrobiyal stresten korumak için hayati öneme sahip olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. Etanol Direnç Testi

1. Biyofilm yetiştirin ve 30 °C'de 68 saat büyümeden sonra, bir jilet ve şablon yardımıyla biyofilm kolonilerini eşit iki parçaya ayırın.
2. Biyofilm kolonisinin her yarısını küçük bir spatula ile agar plakasından dikkatlice kaldırın ve 500 μl fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) içeren 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Gerekirse, plakadan kalan hücreleri kazıyıp mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Biyofilm kolonisinin ikinci yarısı, kontrol yapıp olmadığına veya sterilizasyon ajanlarına karşı direncin test edilmesine göre farklı şekilde ele alınır.
3. Kontrol için, biyofilm koloninin ikinci yarısını 500 μl PBS ile inkubasyon yapın. Sterilizasyon ajanlarına karşı direnci değerlendirmek için, biyofilm koloninin ikinci yarısını 500 μl %50 (v/v) etanole aktarın.
   NOT: Sodyum hipoklorit gibi alternatif sterilizasyon ajanları kullanılabilir. Kullanılan tüm sterilizasyon ajanları için, aktif konsantrasyon ve kuluçka süresi ön deneyde belirlenir.
4. Biyofilm kolonilerini oda sıcaklığında tezgah üzerinde 10 dakika kuluçka edin.
5. Biyofilm kolonilerini 18.000 x g hassasiyetinde 5 dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı pipetle dikkatlice çıkarın. 300 μl PBS ekleyin.
6. Hücreleri hafif bir sonikasyon (genlik 10%, nabız 5 saniye) bir sonikatörün mikroucu ile sonikasyon yapın.
   NOT: Sonikasyon enerjisi, biyofilm agregalarını ayırmak için yeterli olmalıdır. Ancak, çok sert sonikasyon hücreleri lizizleyebilir. Işık mikroskopisiyle önceden doğrulayın ki kullanılan sonikasyon enerjisi hücreleri lizize etmese ve tüm agregalar çözünmüştür.
7. Son hacmi 1 ml'ye 700 μl PBS ekleyin. PBS'de seri seyreltme (^10-7) yapın ve steril cam boncuklarla LB-%1,5 agar plaka üzerine 100 μl 3 seyreltme yayın.
   NOT: Kaplama yapılacak optimal seyreltmeler ön deneyde belirlenmelidir; çünkü bu, ilgi gören biyofilm kolonisindeki hücre sayısına ve hücrelerin sterilizasyon ajanına yanıt olarak hayatta kalma oranına bağlıdır.
8. Plakaları gece boyunca 30 °C'de inkübe edin, CFU'yu sayın ve CFU/ml belirlenin. Her yarım biyofilm koloninin nihai CFU/ml sayısından, hayatta kalanların yüzdesini hesaplayın.
   NOT: Açıklandığı gibi uygulanıp analiz edildiğinde, kontrol biyofilm kolonisinin iki yarısı ile tedavi edilmemiş ve etanolle işlenmemiş biyofilm kolonisi yarısı canlı hücre sayısında %10'un altında farklar vermelidir; bu da sırasıyla koloninin simetrisini veya direncini doğrular. Alternatif olarak, sonuçlar toplam CFU olarak temsil edilebilir. Kontrol ve tedavi edilmemiş biyofilm kolonisinin hücre sayıları aynı büyüklük derecesinde kalmalıdır. Buna karşılık, küçük molekülle işlenmiş bir biyofilm kolonisinin etanol ile işlenmiş yarısının hücre sayıları, sterilizasyon ajanına karşı artan hassasiyet iddiası altında en az iki merteme düşmesi beklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Luria Broth, Lennox	Difco	240230
Bacto Agar	Difco	214010
Potasyum fosfat monobazı	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G
Potasyum fosfat dibazi	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
3-(N-morfolino)propansülfonik asit	Fisher Scientific, 209,27 g/mol	BP308-500
Magnezyum klorür heksahidrat	Merck, 203.30 g/mol	1.05833.0250
Kalsiyum klorür susuz	J.T. Baker, 110.98 g/mol	1311-01
Manganez(II) klorür tetrahidrat	Sigma, 197.91 g/mol	31422-250G-R
Demir(III) klorür heksahidrat	Sigma, ayda 270.30 g)	F2877-500G
Çinkoklorür susuz	Acros Organics, 136,29 g/mol	424592500
Tiamin hidroklorür	Sigma, 337,27 g/mol	T1270-100G
L-triptofan	Fisher Scientific, 204.1 g/mol	BP395-100
L-fenilalanin	Sigma, 165,19 g/mol	P5482-100G
L-treonin	Sigma, 119,12 g/mol	T8625-100G
Gliserol ansutiz	Bio-Lab Itd	712022300
L-glutamik asit monosodyum tuzları hidratlar	Sigma, 169,11 g/mol	G1626-1KG
D-lösin	Sigma, 169,11 g/mol	855448-10G
Etanol susuz	Gadot	830000054
Jilet bıçağı	Eddison	NA
Dairesel selüloz filtre kağıtları	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehit	EMS (Elektron Mikoskopi Bilimi), %25 suda	16220
Paraformaldehit	EMS, %16 suda	15710
Sodyum kakodilat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Kalsiyum klorür 2-hidrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Santrifüj	Eppendorf masa üstü santrifüj 5424	NA
Dijital Sonifier, Model 250, Double Step Microtip ile birlikte kullanılır	Branson	NA
Kuluçka makinesi 30 °C	Binder	NA
Kuluçka makinesi 23 °C	Binder	NA
Filtre Sistemi, 500 ml, polistiren	Cornig Incorporated	NA
Döner Sallacı - Orbitron Döner II	Boekel	NA