Morfolojik Analiz için Bakteriyel Biyofilm Kolonilerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Bucher, T. ve diğerleri, B. subtilis biyofilmlerini küçük moleküllü biyofilm inhibitörlerinin karakterizasyonu için bir model olarak inceleme yöntemleri. J. Vis. Exp.(2016)

Bu video, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için olgun bakteriyel biyofilm kolonilerinin hazırlanmasını gösteriyor. Fiksasyon, kurutma, montaj ve metal kaplama adımlarını kapsayarak biyofilm morfolojisini koruma ve görselleştirmeyi içerir.

Protokol

Taramalı Elektron Mikroskopisi için Biyofilm Koloni Örnek Hazırlığı

1. Bakteriyel biyofilm kolonileri yetiştirin.
2. 100 mM sodyum kakodilat içinde %2 (v/v) glutaraldehit, %3 (v/v) paraformaldehit çözeltisi ile taze bir parti hazırlayın; 5 mM kalsiyum klorür tamponu, pH 7.3. 8,5 cm çapındaki her Petri kabı için 5 ml fiksant hazırlayın.
   DIKKAT: Glutaraldehit ve paraformaldehit tehlikelidir. Kimyasal bir kapüşon içinde güvenlik ekipmanlarıyla kullanın. Tehlikeli atıktaki çözeltileri ve kirlenmiş malzemeleri atın.
3. Fiksanti biyofilm kolonilerine dikkatlice ekleyin, biyofilmlerin üzerine doğrudan dağıtmayın.
   NOT: Biyofilm koloninin hidrofobik karakteri nedeniyle, koloniler yavaşça agardan ayrılır ve yüzmeye başlar.
4. Plakaları dikkatlice Parafilm şeritiyle mühürleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca döner bir sallayıcıda kuluçka yapın ve ardından plakaları gece boyunca 4 °C'ye aktarın.
5. Ertesi gün, vakum pompasına bağlı bir Pasteur pipetiyle sıvıyı dikkatlice çıkarın.
6. Biyofilmi yıkamak için dikkatlice 10 ml 100 mM sodyum kakodilat, 5 mM kalsiyum klorür tamponu ekleyin ve 5 dakika kuluçka yapın. Biyofilme zarar vermemek için Pasteur cam pipetiyle sıvıyı plakanın köşesinden nazikçe çıkarın ve nazik pipetle temiz yıkama solüsonu ekleyin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
7. Biyofilm kolonilerinin susuzulması için aşağıdaki adımlara devam edin: 2x 5 dakika_{ddH 2}O; %30 etanolde 2x 20 dakika; %50 etanolde 2x 20 dakika; %70 etanolde 2x 20 dakika; %96 etanolde 2x 20 dakika; %100 etanolde 2 kez 30 dakika.
   1. Her adımda 8,5 cm çapında her Petri kabı için 15 ml sıvı ekleyin ve her kuluçkadan sonra sıvıyı dikkatlice çıkarın.
8. Etanolden numuneleri kurutmak için iki farklı yöntemden birini kullanın.
   1. Etanolden hava kurutma için:
      1. Selüloz filtre kağıdını (çapı 9 cm) dörtlere böl. Kısa süreliğine dörtte birini %100 etanole batırın, ardından dikkatlice bir yüzen biyofilm kolonisini üzerine aktarın. Islak filtre kağıdını filtre kağıdıyla kaplanmış bir Petri kabına koyun. Petri kabını kapatın ve biyofilm kolonilerini gece boyunca kimyasal bir kapüşonda kurutmaya bırakın.
9. Bir elektron mikroskopi bölüğünü karbon bantla kaplayın. Cimset yardımıyla biyofilm kolonilerini dikkatlice kütük üzerine aktarın. Her koloniyi karbon banttan ince bir köprü ekleyerek stub'a bağlayın; bu, elektron ışını altında yük yok edilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu aşamada, biyofilm kolonilerini dikkatle ele alın çünkü çok kırılgandırlar. Numuneleri en az 24 saat veya muayeneye kadar bir kurutucu içinde saklayın.
10. Muayene günü, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile biyofilm kolonilerini altın-paladyum sputter-coater'da 60° açıda 2 dakika boyunca sputter-kaplama ile örtür. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve örnekleri arada 120° döndürün. Sonunda, örnekleri üst kısımdan 3 dakika boyunca bir kez sputter-kaplama ile örtün. 20 nm ince altın-paladyum tabakası, taramalı elektron mikroskopisinde görüntüleme için iletkenliği artırır ve kontrastı artırır.
11. Numuneler, numunenin yeniden hidratlanmasını önlemek için bir kurutucu içinde saklanır ve taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gliserol ansutiz	Bio-Lab Itd	712022300
Etanol susuz	Gadot	830000054
Jilet bıçağı	Eddison	NA
Dairesel selüloz filtre kağıtları	Whatman, 90 mm	1001-090
Glutaraldehit	EMS (Elektron Mikoskopi Bilimi), %25 suda	16220
Paraformaldehit	EMS, %16 suda	15710
Sodyum kakodilat	Merck, 214,05 g/mol	8.2067
Kalsiyum klorür 2-hidrat	Merck, 147,02 g/mol	1172113
Kıvrım-alüminyum montaj	EMS, yuvalı kafa	75230
Karbon yapışkan bant	EMS	77825-12
Shaker 37 °C	New Brunswick Scientific Innowa42	NA
Kuluçka makinesi 30 °C	Binder	NA
Kuluçka makinesi 23 °C	Binder	NA
Döner Sallacı - Orbitron Döner II	Boekel	NA
S150 Sputter Coater	Edwards	NA
Çevresel Taramalı Elektron Mikroskobu	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA