In vitro bakteriyel biyofilm oluşumu için odalı bir kapak cam yöntemi

Özet

Kaynak: Beaudoin, T. ve diğerleri. Balgamın biyofilm gelişimi üzerindeki etkilerini odalı bir örtü cam modeli kullanarak görselleştirmek. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, kistik fibrozis hastasından kaynaklanan balgam konak faktörlerinin bakteriyel biyofilm gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için odalı bir örtü camının kullanımını göstermektedir.

Protokol

Örnek toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Biyofilm Oluşumu için Odalı Kapak Cam Yöntemi
   1. İlgilendiğiniz bakteriyel izoleti, istenen ortamda 37 °C'de gece boyunca sallanma (200 rpm) ile yetiştirin.
      NOT: Klinik izolatlar Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia kompleksi ve Achromobacter xylosoxidans dahil olmak üzere çeşitli bakteriler kullanıldı.Medya seçimi ilgi gören suşlara ve koşullara bağlıdır, ancak (Luria çorbası) LB ortamı ilk deneyler için kullanılabilir.
   2. Gece kültüründen 40 μl kültürü 4 ml taze ortama yerleştirin ve 37 °C'de (200 RPM) çalkalama ile 3-4 saat boyunca büyütür; böylece 600 nm (OD600) optik yoğunluğu yaklaşık 0,5-0,6 olarak elde edilir.
   3. Kültürü 1.2'den 1/5'e kadar istenen ortamda, %10 balgam filtratı ile veya balgam filtratı olmadan (kontrol olarak) seyreltin. Balgam filtratının diğer konsantrasyonları da test edilebilir (örneğin, %50 veya %100).
   4. Sulandırmanın 200 μl kısmını slayt odalarının kuyularını tohumlamak için kullanın.
   5. Bakterilerin 37 °C'de 4 saat boyunca sarsmadan birikmesine izin verin.
   6. 4 saat sonra ortamı çıkarın ve biyofilmi 1x taze maddeyle nazikçe yıkayın. 200 μl taze ortam ile değiştirin.
      NOT: Balgamın biyofilm üzerindeki etkilerini incelemek için, taze ortamda balgam süpernatantı bulunmalıdır.
   7. Biyofilmlerin 37 °C'de istenen süre boyunca sallanmadan büyümesine izin verin; her 12 saatte bir medyayı değiştirin, mikroskopi zamanına kadar yıkamadan.
      NOT: Balgam süpernatantlarının biyofilm antibiyotik hassasiyeti üzerindeki etkisini incelemek için, biyofilm büyümesinin ardından 24 saatlik biyofilm büyümesinden sonra ortama antibiyotikler eklenir ve biyofilmlerin boyama ve görüntüleme işlemlerine kadar ortamda tutulur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lab-Tek II Odalı kaplama camı, #1.5 borosilikat, 8 kuyu	Thermo Sicher Scientific	155409
Millers LB Suyu	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Gece içinde büyüme/biyofilm büyümesi için standart medya