Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Özet

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Zebrabalıkların Gıda Yoluyla Enfeksiyonu
   1. Paramecia ile bakterileri kuluçka altına alın.
      1. Enfeksiyondan önceki gece Paramecium caudatum ve Escherichia coli MG1655'in ortak kültürünü hazırlayın. 8 mL E3 ortamı, 1 mL devam eden paramecia kültürü ve 1 mL E. coli MG1655 kültürü (OD₆₀₀ = 1.0) 1x E3 ile T25 doku kültürü şölelerinde yeniden süspansiyona getirilmiştir. Termosları oda sıcaklığında (RT) gece boyunca inkübe edin. Her tedavi durumu için iki parmecia şişesi hazırlayın.
      2. Bakteri büyüme ortamı (LB (Lizojeni Sçorbası): 1 g/L tripton, 0.5 g/L maya ekstraktı, 1 g/L NaCl) bakteri suşuyla aşılamak, bir plakadan tek bir bakteri kolonisi steril aşılama döngüsü kullanılarak alınır. Sıvı kültürü 37 °C'de inkübe yapın ve gece boyunca dakikada 110 dönüş (rpm) hızında sallanmaya bırakın.
         NOT: Kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü ve eldiven) giyilmeli ve enfeksiyon ajanlarıyla ilgilenirken biyolojik güvenlik seviye 2 tesisler kullanılmalıdır.
      3. Ertesi gün, gece kültürünün_{OD 600'ünü} ölçün. 11 mL ortamda yeniden süspansiyon edildiğinde OD600 1'e ulaşmak için gereken kültür hacmini hesaplayın.
      4. Bakteri hacmini santrifüjle 6.000 x g ile 5 dakika boyunca hasat edin, her paramecia şişesi için bir hacim. Süpernatantı atın ve bakteriyel pelleti 1 mL E3 ortamında yeniden süspansiyona alın.
      5. İsteğe göre, bakteriyi floresan bir boya ile önceden boyayabilirsiniz.
         1. 1 μL FM 4-64FX bakteri boyama (5 mg/mL stok çözeltisi) ekleyin. Foto ağartmadan korumak için boru folga ile örtün ve RT (Oda sıcaklığında) 15 dakika boyunca dönen dönen inkübe yapın.
         2. Fazla boya 1x E3 ile yıkayarak alın: Pellet bakterileri 6.000 x g sıcaklığında santrifüjle 1,5 dakika boyunca kullanın, ardından pelleti 1 mL E3 ortamında tekrar askıya alın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
         3. Lekeli bakterileri 6.000 x g g'de 5 dakika boyunca cntrifugasyon yoluyla toplayın. Süpernatantı atın ve bakteriyel pelleti 1 mL E3 ortamında yeniden süspansiyona alın.
      6. Her iki taze paramecia şişesine 1 mL bakteri süspansiyon ekleyin. RT'de 2 saat kuluçka yapın.
         NOT: Lekelenmiş bakterilerle çalışıyorsanız, RT'de 2 saat karanlıkta kuluçka yapın
2. Wash bakteri/paramecia ortak kültürü
   1. Paramecia/bakteri birlikte kültür yapılan her iki şişenin içeriğini 50 mL'lik konik bir tüpte birleştirin. Santrifüj örnekleri 300 x g sıcaklıkta, 15 °C'de 10 dakika boyunca alın. Bu adımdan önce santrifüjün önceden soğuttulduğundan emin olun.
   2. Serolojik pipet kullanarak yaklaşık 10 mL E3 süpernatantını çıkarın ve konik tüpe yaklaşık 10 mL taze 1x E3 ekleyin.
      NOT: Tüm yıkama adımlarında, süpernatantı çıkarırken çok hızlı olmak önemlidir, çünkü paramecia peletten yüzmeye başlar. Bu adımda hızlı bir şekilde işlenilmesini sağlamak ve süpernatantın paramecia kaybını önlemek için tüpten tek bir tüpten çevirin ve çıkarın.
   3. Örnekleri 300 x g sıcaklığında 15 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle çevirin. Serolojik pipet kullanarak yaklaşık 10 mL E3 süpernatantını çıkarın ve konik tüpe yaklaşık 10 mL taze 1x E3 ekleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
   4. Santrifüj örnekleri 300 x g ve 15 °C'de 5 dakika boyunca alın. Yaklaşık 10 ml E3 süpernatantını çıkarın, pelleti bozmamaya özen gösterin.
   5. Pelleti kalan 10 mL E3 ortamına yeniden süspansiyon ve 500 μL süspansiyonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Paramecia'nın 500 μL'sini 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjle geçirerek paramecia sayısını sayın.
   6. 500 μL örnekten 400 μL E3 süpernatantı alın. Kalan 100 μL paramecia üzerine 20 μL %36,5 formaldehit çözeltisi ekleyin ve nazikçe yeniden süzülür ve 22 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Bu adım, saymaya izin vermek için paramecia'yı öldürür.
   7. Pipetle gerçek toplam hacmi ölçün ve kaydedin. Paramecia süspansiyonunu %0,4 tripan mavi çözeltisiyle 1:1 v/v oranında seyreltin.
   8. Ölü paramecia/mL sayısını saymak için hücre sayacı veya hemositometre kullanın.
      NOT: Önceki fiksasyon adımı nedeniyle, çoğu paramecia bu noktada ölü olur, ancak bu sayı, birlikte kuluçka deneyi için canlı paramecia sayısını yansıtır. Yazarlar, bakteriyel birlikte kuluçka nedeniyle önemli paramecia ölümleri bulmamışlardır, bu yüzden bu bir faktör olarak göz ardı edilebilir.
3. Paramecia ve zebrafish larvalarını birlikte kuluçka yapın
   1. 50 mL'lik konik tüpteki paramecia konsantrasyonunu hesaplayın
   2. E3'ün son hacminde 2 x 10^{5 paramecia} /mL konsantrasyon için gereken yıkanmış paramecia hacmi hesaplanın.
      NOT: Paramecia konsantrasyonu, istenen bakteri dozuna göre ayarlanabilir ve bu da optimizasyona tabidir.
   3. Zebra balıklarını anestezi edin, 100 mM Tris pH 8.0 ile trikain ekleyerek nihai konsantrasyon 100 mg/L. 6 kuyuluğa ait her bir kuyuya, uygun paramecia konsantrasyonu içeren toplam 3 mL taze E3 hacmine 10 zebra balığını aktarın. Larvaların anesteziden iyileşmesi için alıcı kuyuya minimum miktarda sıvı içinde aktarıldığından emin olun.
   4. Av için en uygun aydınlatma koşullarını sağlamak amacıyla gündüz koşullarında gündüz koşullarında 30 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
   5. Zebra balıklarını her seferinde 100 mg/L trikain içeren 3 mL taze E3 içeren yeni bir kuyuya aktararak en az 5 kez yıkayın.
      NOT: Yıkama aşamasında trikaini çıkarmaya çalışmayın. Hareketli larvaların anestezi olmadan aktarılması, hayvanın hasar ve sıkıntı riskini artırır.
   6. İsteğe göre, zebra balıklarını görüntülemeye hazırlayın; zebra balığı siyah duvarlı 6 kuyu plakada %1 düşük erimeli agaroza gömülür: Düşük eriyen agaroz 1xE3 ile yapılır ve mikrodalgada ısıtılır. Eridikten sonra, trikaini son konsantrasyon olan 160 mg/mL'ye ekleyin. Balıkları stereomikroskop altında, kesilmiş jel yükleme ucu kullanarak konumlandırın; başın solda, kuyruğun sağda olduğundan emin olun (Şekil 1). Agarozun berbatlaşmasını 5 dakika bekleyin, ardından gömülü balığı 160 mg/mL trikain içeren 1x E3 ile örtün, görüntüleme için kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebra balıklarının bakterilerle kolonizasyonu. 5 dpf seviyesinde zebra balıkları enfekte edilmemiş (A) veya mCherry ile kolonize edilmiş (B) E. coli veya (C) Salmonella ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Paramecium caudatum, canlı	Carolina	131554	Hayır, yetiştirici kültürleri oda sıcaklığının altında saklamayacağın
%0,4 Trypan Blue Çözeltisi	Sigma	T8154-20ML	sıvı, steril filtreli, hücre kültürü için uygun; %0,81 sodyum klorür ve %0,06 potasyum fosfatta hazırlanmıştır, dibazik
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	276855-100ML	Solvent güvenlik dolabında depolayın
Escherichia coli, MG1655	ATCC	ATCC 700926	diğer patojenik olmayan herhangi bir E. coli suşuyla değiştirilebilir
FM 4-64FX lekelenmesi	Thermo Fisher	F34653	Aliquot ve Store Frozen
Formaldehit	Sigma	F8775-4X25ML
LB Bulbarı	Sigma	L3397-1KG
Fosfat tamponlu tuzlu tabletler	Thermo Fisher	18912014
Tetrasiklin	Sigma	87128-25G	Zehirli, tahriş edici
Trikain (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat)	Sigma	E10521-10G
Triton X-100	Sigma	X100-100ML
Trypan Blue Solution, %0,4	Sigma	93595-50ML
UltraPure Düşük Erime Noktası Agaroz	Thermo Fisher	16520050
Hemositometre veya hücre sayacı	herhangi bir
Stereomikroskop	herhangi bir
Masa üstü santrifüj
Mikrodalga
Döner tekerlek
Isıtılan sallama kuluçka makinesi
Su sporları tesisleri
Üreme tankları