Elektrokimyasal Reaktör Kullanarak Bakteriyel Tek Katmanlı Biyofilm Geliştirilmesi

Özet

Kaynak: Tokunou, Y. ve ark., Shewanella oneidensis MR-1'de Deuteryum Kinetik İzotopunun Elektrokimyasal Tespiti Hücre Dışı Elektron Taşınımına Etkisi. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, elektrot yüzeylerinde biyofilm oluşumunu simüle etmek için tasarlanmış bir elektrokimyasal reaktör modelinin montajını ve çalışmasını gösteriyor. Kontrollü elektrokimyasal uyarım, mikrobiyal yapışmayı teşvik eder ve bu da bakteriyel monotabakalı biyofilmin kademeli gelişimine yol açar.

Protokol

1. Üç elektrotlu bir elektrokimyasal reaktörün inşası (Şekil 1)
   1. Reaktörün altına çalışan elektrot olarak indium kalay doped oksit (ITO) substratı koyun.
   2. Daha sonra, çapı 2 cm olan bir cam silindir ve politetrafloroetilen (PTFE) kapağı yerleştirin. Daha sonra gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) (potasyum klorür, KCl doymuş) ve bir platin teli reaktöre referans ve karşı elektrot olarak yerleştirin.
      NOT: Hava ve çözelti sızıntısını önlemek için, her bileşenin arasına bir bütil kauçuk levha yerleştirin.
   3. Elektrokimyasal reaktöre 4,0 mL tanımlanmış ortam (DM) eklenerek 10 mM laktat ve 0,5 g/L maya ekstraktı eklenir.
   4. Elektrokimyasal reaktörden sızıntı olmadığından emin olunduktan sonra, azot gazını elektrokimyasal reaktöre 20 dakika boyunca akarak elektrokimyasal reaktör içinde anaerobik koşulları koruyun.
      NOT: Diğer mikroplarla kontaminasyonu önlemek için, gaz elektrokimyasal reaktöre akmadan önce filtrelenmelidir.
   5. Elektrokimyasal reaktörü bir potensiostata bağlayın ve ITO elektrotuna +0,4 V (standart hidrojen elektrot SHE'ye karşı) uygulanarak elektrokimyasal reaktörün sıcaklığını harici su dolaşım sistemi kullanarak 30 °C tutar.
      NOT: Dış bir elektrik alanının etkisini önlemek için elektrokimyasal reaktör Faraday kafesine yerleştirilmelidir.
2. S. oneidensis MR-1 hücrelerinin elektrokimyasal yetiştirilişi (Şekil 1 ve Şekil 2)
   1. 1.1. adımda elde edilen süspansiyonun hücre yoğunluğunu, DM ile 10 mM laktat ve 0,5 g/L maya ekstraktı ile desteklenen 600 nm'de 1,43 optik yoğunluğa ayarlayın (OD₆₀₀).
      NOT: Doğru OD_600'ü elde etmek için, OD₆₀₀ ≤ 0.8'in hücre askısını UV-vis spektrometresine uygulayarak OD_600'ü 1.43'e ayarlayın.
   2. Enjeksiyon portundan elektrokimyasal reaktöre 0.3 mL hücre süspansiyonu bir şırınga ile eklenirken: reaktördeki OD₆₀₀ 0.1'e dönüşür.
      NOT: OD₆₀₀ = 1.43 ile 0.3 mL hücre süspansiyonunun 4.0 mL ortam içeren bir elektrokimyasal reaktöre eklenmesi, 4.3 mL çözelti ve OD₆₀₀ = 0.1 ile sonuçlanır. Farklı hacimli diğer reaktörler kullanılırken, hücre yoğunluğunun hesaplanması gereklidir.
   3. ITO elektrotuna +0.4 V'da (SHE aksine) potansiyel uygulamasına 25 saat devam edin.
      NOT: ITO elektrotunda tek katmanlı biyofilm oluşumu için, üretilen akımın Şekil 2'den %50'den daha az sapma gösterdiğinden emin olun.

Sonuçlar

Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan elektrokimyasal reaktör. Elektrokimyasal hücrenin inşaat öncesi fotoğrafı (a) ve inşaat sonrası (b). (c) +0.4 V ile 25 saat elektrokimyasal aşılamadan sonra elektrokimyasal reaktörün şematik çizimi, SHE ile karşılaştırıl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cam silindir	Yok	Yok	Özel yapım, elektrokimyasal reaktör olarak kullanılıyor
PTFE örtü ve taban	Yok	Yok	Özel yapım, elektrokimyasal reaktörün kapağı ve temeli olarak kullanılmıştır
Bütil kauçuk	Yok	Yok	Elektrokimyasal reaktörün her bileşeni arasına özel olarak yerleştirilmiş
Septa	GL Bilim	3007-16101	Elektrokimyasal reaktörün enjeksiyon portu olarak kullanılır
İndiyüm kalay doplanmış oksit (ITO) elektrotu	GEOMATEC	No.0001	Çalışan elektrot olarak kullanılır, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl doygun elektrot	HOKUTO DENKO	HX-R5	Referans elektrot olarak kullanılan, Φ0.30mm
Platin tel	Nilaco Kooperatifi	PT-351325	Karşı elektrot olarak kullanılır
Luria-Bertani (LB) Bro, Miller	Becton, Dichkinson ve Şirketi	244620	S. oneidensis MR-1'in ön yetiştirilmesi için ortam
Bacto agar	Becton, Dichkinson ve Şirketi	214010
NaHCO₃	Wako	191-01305	Tanımlanmış ortam (DM) için kullanılır
CaCl₂·2H₂O	Wako	031-00435	DM için kullanıldı
NH₄Cl	Wako	011-03015	DM için kullanıldı
MgCl₂·6H₂O	Wako	135-00165	DM için kullanıldı
NaCl	Wako	191-01665	DM için kullanıldı
2-[4-(2-hidroksietil)-1-piperazinil] etansülfonik asit (HEPES)	DOJINDO	346-08235	DM için kullanıldı
Sodyum Laktat Çözeltisi	Wako	195-02305
Bacto maya özlü	Becton, Dichkinson ve Şirketi	212750
Döteryum oksit (D, %99,9)	Cambridge İzotop Laboratuvarları, Inc.	DLM-4-PK	Kinetik izotop etkisi deneyleri için ekleme
Kuluçka makinesi	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Ön yetiştirme için kullanılır
Shaker	TAITEC	NR-3	Ön yetiştirme için kullanılır
Otoklav makinesi	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Elektrokimyasal reaktör ve ortamın sterilizasyonu için kullanılır
Temiz bankta	SANYO	MCV-91BNF	Elektrokimyasal reaktör ve ortamın diğer mikroplarla kontaminasyonunu önlemek için kullanılır
Santrifüj ayırıcı	Eppendorf	5430R	6000×g'ye kadar dönme hızı gereklidir
Azot gazı jeneratörü	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Azot gazı silindiri de gaz jeneratörü yerine kullanılabilir
UV-vis spektrometresi	SHIMADZU	UV-1800	Hücre yoğunluğunun optimizasyonu için kullanılır
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Biyofilm oluşumu ve kinetik izotop etkisi deneylerinde kullanılır
Termal su sirkülatörü	TEK KİMİ	TR-1A	Elektrokimyasal reaktörün sıcaklığının korunması için kullanılır
Faraday kafesi	HOKUTO DENKO	HS-201S	Elektrokimyasal deneyler için kullanılır