GFP etiketli SKN-1 kullanılarak C. elegans'ta patojenin neden olduğu oksidatif stresin görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Naji, A. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans'ta mitis grubu streptokoklarının neden olduğu oksidatif stresin incelenmesi. J. Vis. Exp. (2019)

Bu video, C. elegans'ta yeşil floresan protein etiketli SKN-1'in yeşil floresan stresi izlemek için yeşil floresan stresi izlemesini ve yeşil floresansı izlemeyi göstermektedir. S. gordonii'ye maruz kalan solucanlar güçlü nükleer floresans gösterir ve bu patojenlerden kaynaklanan stresi doğrularken, E. coli ile beslenenler sitoplazmada dağınık yeşil floresans gösterir ve bu da minimal SKN-1 aktivasyonunu gösterir.

Protokol

1. Streptococcus gordonii enfeksiyonuna yanıt olarak SKN-1 lokalizasyonunun gözlemlenmesi

1. Streptococcus tohumlu her Todd–Hewitt maya özdüsüne (THY) ve Escherichia coli (E. coli) tohumlu her nematod büyüme ortamına (NGM) agar plakasına ~100 L4 larva ekleyin. Her bakteri türü için üç plaka kullanın. Plakaları 2 ila 3 saat boyunca 25 °C'de kuluçka yapın.
2. Daha sonra, levhalar kuluçka makinesinden çıkarılır, modifiye edilmiş bir M9 tamponu (M9W) ile yıkanır ve solucanları 15 mL konik tüplerde toplar.
3. Solucanları 3 kez yıkayın.
4. M9W'nin büyük kısmı aspirasyonla çıkarılır ve solucan pelletine 2 mM sodyum azid veya 2 mM tetramisol hidroklorür içeren 500 μL M9W eklenir. Bu, solucanları anestezi eder ve mikroskop altında görüntülendiğinde hiçbir hareket yaşanmaz.
   DIKKAT: Sodyum azidi kullanırken kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın. Azide çözeltisini kimyasal bir kapüşon altında hazırlayın.
5. Solucan pelletlerini oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçka yapın. Sonra, hazırlanmış bir agaroz pedine 15 μL solucan süspansiyonu yerleştirin. Anestezi edilmiş solucanların bulunduğu agaroz pedinin üzerine nazikçe 1.5 numaralı bir örtü koyun.
6. Floresan mikroskop kullanarak, floressein izotiosiyanat (FITC) ve 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) filtreleri kullanılarak Skinhead ailesinin transkripsiyon faktörü 1 veya SKN-1:GFP (Yeşil Floresan Protein etiketli SKN-1) lokalizasyonunu görselleştirin. Görüntü solucanları 10x ve 20x büyütmelerde.
7. Solucanları SKN-1'in lokalizasyon seviyesine göre puanlayın. Solucanın ön veya arka kısmında SKN-1B/C::GFP (Green Fluorescent Protein-tagged SKN-1 izoform B/C) nükleer lokalizasyonu yok ve SKN-1B/C::GFP'nin tüm bağırsak hücrelerinde nükleer lokalizasyonu sırasıyla düşük, orta ve yüksek lokalizasyon seviyeleri olarak kategorize edilir.
8. Flüoresan mikrograflar puanlandıktan sonra, istatistiksel farklılıkları ki-kare ile ve Fisher'ın kesin testleriyle statistiksel yazılım kullanılarak belirleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Medya ve kimyasallar
BD Bacto Todd Hewitt çorbası	Fisher Scientific	DF0492-17-6
15 mL Konik steril polipropilen santrifüj tüpleri	Fisher Scientific	12-565-269
Sodyum azid	Sigma Aldrich	S2002-25G
Tetramisol hidroklorür	Sigma Aldrich	L9756
No.1.5 18 mm x 18 mm kapak kaydırmaları	Fisher Scientific	12-541A
Agarose	Sigma Aldrich	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006)	Keith Blackwell