Bakteriyel akciğer enfeksiyonlarını belirlemek için fare orofaringeal aspirasyon modelinin hazırlanması

Özet

Kaynak: Nielsen, T. B. ve diğerleri, Ventilatörle ilişkili ve hastanede edinilen bakteriyel zatürrenin Murine Orofaringeal Aspirasyon Modeli. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, bakterilerin anestezi altında bir farenin akciğerlerine orofarenks üzerinden aktarılması, akciğer enfeksiyonu ve bağışıklık yanıtı tetiklenmesi prosedürünü gösteriyor.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Aşılama/Enfekte Edici Fareler

1. Anestezi edilmiş bir fareyi üst kesici dişlerinden, çalışma yüzeyinden yaklaşık iki kat (örneğin, 20 cm) yükseklikte, sabit bir nesneye sabitlenmiş güçlü ve ince bir iple (örneğin diş ipi gibi) asarak (örneğin, laboratuvar tezgahı).
2. Steril, kör uçlu forsepslerle farenin dilini ağzından nazikçe çek. Dili, farenin dilinin yanlışlıkla ezilmesini önlemek için steril, eldivenli bir parmağa aktarın. Dili ağzın dışında tutarak orofarinkse erişim sağlayacak ve aşının yan tarafa yutulmasını engelleyin.
3. Farenin dilini tutarken, 50-μL inokulumu (bakteriyel süspansiyon) mikropipet kullanarak orofarenks'e yerleştirin; Orofarenks, ağız boşluğu ile farinksin ağzın arka tarafına doğru birleştiği noktada yer alır.
   NOT: Sıvıyı sadece mikropipetin ilk durağına pipetle ulaştırmak çok önemlidir. Aşı orofarenks'e yerleştirildiğinde fare birkaç saniyeliğine nefes almayı durdurur; Sonunda, refleksif aspirasyon farenin bakteriyel süspansiyonu solumasına neden olur; bu, sıvının akciğerlere giren belirgin çıtırtı sesi ile belirtilir ve bu da zatürre enfeksiyonuna yol açar.
4. Eğer aşı normal solunumu engelleyecek kadar geride değilse, burunları forsepsle sıkıştırarak refleks aspirasyonu ağızdan geçirip ardından inokulumun solumasını sağlar.
5. Aşılamadan sonra dili serbest bırakın, fareyi askı ipinden çıkarın, bir kafese yerleştirin ve anesteziden uyanana kadar izleyin.

2. Hastalık İlerlemesini İzlemek

NOT: Hayvanların acı çektiği için, farelerin ne zaman öldüğünü göstermek için çeşitli göstergeler kullanılmalıdır; Ötenazi, bu karardan sonra, önceden onaylanmış IACUC protokolüne uygun olarak yapılmalıdır; Ölümcüllüğün çeşitli göstergeleri arasında vücut ısı, kilo kaybı, görünüm, yürüyüş ve kandan elde edilebilen diğer biyobelirteçler (örneğin, iSTAT aracılığıyla) bulunur.

1. Fareleri önceden onaylanmış IACUC protokolüne göre ötenazi yapın (örneğin, CO₂ ve ardından servikal dislokasyon).
2. Ötenazi yapılan bir farenin akciğerlerini, akciğerlere yakın trakea, akciğer arteri ve akciğer venini keserek alınır.
   1. Mikroskopi
      1. Akciğerleri (veya bir kısmı) örnek kalıbına yerleştirin.
      2. Numune kalıbını dokuyu tamamen batırarak optimal kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğiyle doldurun.
      3. Örneği -80 °C'de dondurun.
      4. Örneği patoloji laboratuvarına gönderin, böylece mikroskopi için slaytlara monte edilin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anestezi Odası	Kent Bilimsel Şirketi	VetFlo-0720	5 fareye kadar ağırlayabilir
Cryomold, Orta Boyut	Sakura Tissue-Tek	4566	Tek kullanımlık vinil numune kalıpları, 15×15×5 mm
Diş İpi	Oral-B	37000469537	Masa yüksekliğinden yaklaşık 6" yükseklikte ahır direğe bağla
Forseps	VWR	82027-440	Fare'nin ağzından nazikçe dil çekmek için kullanılırdı
Anestezi için izofluran	Abbott	10015516	Alternatif ilaç kullanılabilir; Prosedürü buna göre değiştirin
iSTAT Kartuşu	Abbott	03P79-25	İhtiyaçlarınıza uygun çeşitli kartuşlar mevcuttur
Ketamin, 100 mg/mL	Batı Tıbbi Tedarik	4165	PBS'yi 1:10 derecesinde 1 mg/mL'ye seyreldin ve 1 mg/mL'de Xylazine ile birleştirin
Gözler için Merhem	Akorn	Gözyaşları yenilendi	Dağıtıcının ucuyla göze dokunmaktan kaçının
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)	Corning	21-031-CM	Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco'nun PBS'si
Pipet uçları, 200-μL	VWR	10017-044	Kullanımdan önce otoklav
Pipetter, 200-μL	Gilson	Pipetman P200	Otoklav ve kalibrasyon kullanımdan önce
Yayıcı, Bakteriyel Hücre	Bel-Art	F377360006	Her kullanımdan önce fırında veya otoklav ile sterilize edin
Flakon, Kriyojenik, 2.0 mL	Corning	430659	Konsantre bakteriyel inokulanın kriyojenik depolanması için kullanılır