Fotosensitator öncüsü kullanılarak bakteriyel biyofilmlerin ışıkla aktif tedavisi

Özet

Kaynak: Zhao, K. ve diğerleri. 5-aminolevulinik asit aracılı fotodinamik tedavinin Staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki etkisini incelemek için in vitro model. J. Vis. Exp. (2018)

Video, Gram-pozitif bakteriyel biyofilmler üzerindeki antibakteriyel etkileri değerlendirmek için fotodinamik bir tedavi protokolünü gösteriyor. Biyofilmler dört gruba ayrılır: ikisi fotosensitator öncül alır, ikisi ise bir tampon alır. Hepsi karanlıkta kuluçka yapılır, ardından bir öncül işlenmiş gruba ve bir tampon gruba kırmızı ışığa maruz kalır. Reaktif oksijen türleri yalnızca hem öncü hem de ışık alan grupta üretilir ve bu da bakteriyel hücre ölümüne yol açar. Tedavi etkinliği değerlendirilmek için tüm gruplar arasında canlılık karşılaştırılır.

Protokol

1. Biyofilm oluşumu

1. 96 delikli mikroplakalarda biyofilm oluşumu
   1. Staphylococcus aureus suşu USA300 ve -80 °C sıcaklıkta depolanan 3 biyofilm oluşturan klinik suş (C1-C3) alın.
      NOT: Klinik suşların biyofilm oluşturma yeteneği mikrotiter plaka testi ile belirlendi.
   2. Bakteriyi 5 mL tripton soya suyu (TSB) ortamında aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak inkubatörde yetiştirin ve sabit faza geçin.
   3. Gece boyunca bakteriyel kültürü 4.000 × g ile 25 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın. Pelletleri fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla (PBS) 2.0 × 10⁹ Koloni oluşturma birimi (CFU)/mL nihai konsantrasyona yeniden süzülür.
      NOT: Bakterinin konsantrasyonu optik yoğunluk ölçümüyle tahmin edildi ve plaka sayısıyla da belirlendi; 1 OD₆₀₀ süspansiyonda 1.5 ×^10.8 CFU/mL bulundu.
   4. Bakteriyel süspansiyonu %0,5 glikoz içeren TSB ortamında 1:200 (1,0 ×^{10 7} CFU/mL) olarak seyreltin. Hücre kültürünle işlenmiş polistiren 96 delik mikroplakanın her kuyusuna 200 μL bakteri süspansiyonu aşılayın.
   5. Mikroplakayı iyi oksijenli bir ortamda 37 °C'de 24 saat boyunca statik olarak inkubka edin.
      NOT: Olgun biyofilm oluşumunun kuluçka süresi farklı bakteri suşları için değişiklik gösterebilir; bu, Fotodinamik Terapi (PDT) deneyinden önce belirlenmelidir.
   6. Kuyruklardaki medyayı atın ve mikroplaka kuyularını PBS ile nazikçe üç kez yıkayın ve ardından süpernatantı atın.
      NOT: Bu adım, oluşturulmuş biyofilmi rahatsız etmemek için çok nazik yapılmalıdır.

2. Hafif Aşıtlama

1. 5-aminolevulinik asit (5-ALA) 4 °C bir buzdolabında saklanın. Deneyden önce, PBS ile 5-ALA'yı 10 mM'e seyreltin.
   NOT: 5-ALA çözeltisi deneyden önce taze hazırlanmalıdır.
2. Deneysel grupta, mikroplakanın her kuyusuna 200 μL 10 mM ALA veya kültür kabına 2 mL eklenin. Tabağı/kabı alüminyum folyo ile kaplayın ve 1 saat kuluçka yapın. Sonra, plaka/çanak, 100 mW/^{cm ışık} yoğunluğunda bir LED (LED) ile 1 saat boyunca ışınlanarak 633 ± 10 nm ana dalga boyunda 360 J/^cm2 ışık dozu elde edin.
   NOT: Işık enerjisinin tüm kuyular / çanaklarda biyofilme etkili ve eşit şekilde iletilmesi için, ışık kaynağının zirvesinden kuyu/çanakya olan mesafeyi 6,0 cm olarak sabitleyin ve deneysel bölgeyi merkezi radyasyon alanıyla (10 cm × 8 cm) sınırlayın. Sonuçların tekrarlanabilir olmasını sağlamak için deneyler aynı oda sıcaklığında yapılmalıdır. LED ışınlama aşamasında, plakanın güneş ışığı, oda aydınlatması veya lamba ışığı gibi diğer ışık kaynaklarına doğrudan maruz kalmaması için, plaka/çanak ışınlanma alanına taşınmadan önce LED açılır ve ışık işlemi tamamlamak için yeterince parlak olurdu.
3. Kontrol gruplarını kurduk (bizim deneyimizde üç kontrol grubu oluşturuldu).
   1. İlk kontrol grubu (ALA-LED-) için, mikroplakanın her kuyusuna 200 μL PBS veya kültür kabına 2 mL ekleyin. Tabağı/kabı alüminyum folyo ile kaplayın ve 2 saat kuluçka yapın.
   2. İkinci kontrol grubu (ALA+LED-) için, mikroplakanın her kuyusuna 200 μL 10 mM ALA veya kültür kabına 2 mL ekleyin. Tabağı/kabı alüminyum folyo ile kaplayın ve 2 saat kuluçka yapın.
   3. Üçüncü kontrol grubu (ALA-LED+) için, mikroplakanın her kuyusuna 200 μL PBS veya kültür kabına 2 mL ekleyin. Tabağı/kabı alüminyum folyo ile kaplayın ve 1 saat kuluçka yapın. Sonra, plakayı LED'e 360 J/^{cm 2} ışık ışını ile 633 ± 10 nm büyük dalga boyunda maruz bırakın.
      NOT: LED ışınlama adımında, plakanın güneş ışığı, oda aydınlatması veya lamba ışığı gibi diğer ışık kaynaklarına doğrudan maruz kalmasından kaçının.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tripton Soya Suyu (TSB)	OXOID	CM0129B
SYTO9	Thermo Fisher Scientific	L7012	CANLI/ÖLÜ BacLight Bakteriyel Yaşam Kitleri
Propidium iyodid (PI)	Thermo Fisher Scientific	L7012	CANLI/ÖLÜ BacLight Bakteriyel Yaşam Kitleri
5-aminolevülinik asit (ALA)	Fudan Zhangjiang Bio-Pharm	3.1
Staphylococcus aureus suşu USA300			USA 300 referansları
Staphylococcus aureus klinik suşları (C1-C3)			Tüm klinik suşlar, kronik rinosinüzitli hastalardan izole edildi
96-kuyu mikroplakası	Corning Inc	3599	Şeffaf Düz Tabanlı polistiren TC ile işlenmiş mikroplakalar, Tek Tek Sarılı, Kapaklı, Steril
Eppendorf mikrosantrifüj 5417	Eppendorf	Z365998 | SIGMA
Kuluçka makinesi	Thermo Fisher Scientific	SHKE4000	MaxQ 4000 Tezgah Üstü Yörünge Sallayıcılar
Işık yayan diyot (LED)	Wuhan Yage Optik ve Elektronik Teknik CO	LED-IB