Flüoresans Etiketlenmiş Bakterilerin Örnek Hazırlanması ve Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Chetrit, D. ve diğerleri. Legionella pnömofila nokta/icm salgı sisteminin mekansal ve zamansal özelliklerini çözmek için canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografi uygulanıyor. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, floresan olarak işaretlenmiş patojenik bakterilerin hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. Agarose pedleri önce hazırlanır ve yapıştırıcı bir çerçeve içine yerleştirilir. Hücreleri hareketsiz hale getirmek için pedde floresan protein ifade eden genetik olarak modifiye bakterilerin askıya alınması uygulanır. Çerçeve daha sonra bir kapak ile mühürlenir ve bakterilerin floresan görüntülerini yakalamak için mikroskop altında gözlemlenir.

Protokol

NOT: L. pneumophila'nın büyümesi, manipülasyonu ve görüntülemesini içeren tüm işlemler, yerel yönergelere uygun olarak biyolojik güvenlik seviye 2 laboratuvarında yapılmalıdır.

1. Legionella pnömofila kromozomuna sfGFP'nin allel değişim ve çift seçim stratejisi kullanılarak yerleştirilmesi (Şekil 1, Şekil 2)

1. Gen iplasman vektörü pSR47S11'e aşağıdaki diziyi klonlayın: İlgilenen sitenin yukarısında 1.000 bp yükseklik, ardından sfGFP dizisi, ardından ilgi alanının aşağısında 1.000 bp (Şekil 1). sfGFP dizisi, dört ila sekiz amino asit içeren bir linker ile N-terminus veya C-terminus uçlarına çerçeve içinde yerleştirilmelidir. Ortaya çıkan vektörü Escherichia coli DH5αλpir'e dönüştürün. Daha sonra, 100 μg/mL streptomisin içeren kömür-maya ekstraktı (CYE) agar üzerinde tek koloniler için L. pneumophila (alıcı) çizgisi ve 37 °C'de 5 gün boyunca büyüyün (Şekil 2).
2. Streak L. pneumophila CYE-agar-streptomycin ile 2 gün boyunca 37 °C'de (yoğun yama) büyür. Streak E. coli DH5α, 25 μg/mL kloramfenikol içeren LB agar üzerinde pRK600 yardımcı plazmid (yardımcı) ile dönüştürülmüştür. E. coli'nin DH5αλpir (donör) üzerinde 50 μg/mL kanamisin içeren LB agar üzerinde çizgilendirin.
3. Üçlü çiftleşme yapın: Yardımcı, donör ve alıcı kolonisi, üç suşun yamalarını seçim olmadan bir CYE agar plakasına yerleştirerek 4–8 saat boyunca 37 °C'de kuluçka geçirin. Negatif kontroller olarak, aynı süre boyunca bir yardımcı+alıcı suş karışımı ve bir donor+alıcı suş karışımı kuluçka yapın.
4. Çiftleşme reaksiyonlarını 500 μL ddH₂O ile tekrar askıya alın. 100 μg/mL streptomisin ve 10 μg/mL kanamisin içeren CYE agar üzerindeki reaksiyonların 20 μL ve 50 μL plakasında yeniden askıya alın ve 37 °C'de 5 gün boyunca büyüyün. Ortaya çıkan dört klonu 100 μg/mL streptomisin içeren CYE agar üzerinde çizerek 37 °C'de 5 gün büyütün.
5. %5 sukroz ve 100 μg/mL streptomisin içeren CYE agar üzerinde 16 klon serisi yapın ve 37 °C'de 5 gün boyunca büyüyün. Daha sonra, bu klonlardan 32'sini 100 μg/mL streptomisin içeren CYE agar'da ve 100 μg/mL streptomisin ve 10 μg/mL kanamisin içeren CYE agar'da çizgilendirin ve 37 °C'de 5 gün boyunca büyüyürler.

2. L. pneumophila kromozomuna sfGFP'yi entegre eden klonların izolasyonu

1. CYE-agar-streptomisin plakalarında kanamisine duyarlı olan çizgi klonlar, sfGFP'nin kromozoma koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile yerleştirildiğini doğrular. Yerleştirme birleşimini amplifikasyonlamak için sfGFP genine ve ilgi duyulan kromozomal bölgeye tamamlayıcı primerler kullanın.
   1. Her 10 μM primer çözeltisi ve bir koloniden 0,5 μL karıştırın ve 10 dakika boyunca 95 °C'de denatüre olun. 10 dakika buzda soğutun, 12,5 μL 2x PCR master karışım çözeltisi ekleyin ve PCR analizi yapın.
2. 37 °C'de 2 gün boyunca CYE-agar-streptomisin plakalarında izole kolonileri yoğun şekilde büyütün. Anti-GFP antikoru ile immünoblotasyon yoluyla sfGFP füzyonların ifade seviyelerini ve stabilitesini inceleyin.

3. L. pneumophila'nın Floresan Etiketli Nokta/Icm Bileşenleriyle Canlı Hücre Görüntülemesi

1. Agararoz pedlerinin hazırlanması
   1. Suda yaklaşık 30 mL %1 düşük erimeli agaroz çözeltisi yapın. Mikrodalgada yaklaşık 90 saniye boyunca cam bir şişede ısıtın, ara sıra dönerek agaroz tamamen çözülene kadar.
   2. İki adet 22 x 22 x 0.15 mm³ cam slaytı, 25 x 75 x 1.1 mm³ cam sürgüsünün kenarına birbirinin üstüne yerleştirin. Diğer kenara iki adet 22 x 22 x 0.15^{mm 3} cam sürgü daha yığın.
   3. Erimiş agarozdan yaklaşık 1 mL pipet ile iki üst cam slayt arasındaki orta kaydırmaya ekleyin, ardından erimiş agarozun üzerine 25 x 75 x 1,1 mm³ slayt daha yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumundan kaçınmaya çalışın. Kaydırakları 4 °C'de 15 dakika soğut.
   4. Bir bistüri veya jilet kullanarak, pedi nazikçe küçük kareler halinde kesin, ~5 x 5^{mm 2}. Çift taraflı yapıştırıcı 17 x 28 x 0.25 mm³ çerçeveyi 25 x 75 x 1.1 mm³ cam sürgüye tabitleyin ve sürgüye birkaç ped yerleştirin.
2. Görüntü edinimi
   NOT: SlideBook 6.0 kontrolü altında olan ve katı hal aydınlatma cihazları, CCD monokrom kamera ve 100x objektif lens (1.4 sayısal diyafram) ile donatılmış bir mikroskop için aşağıdaki adımlar açıklanmıştır. Gerekirse, protokol ayarlarına göre özelleştirilebilen uygun donanım ve yazılım konfigürasyonlarına sahip alternatif mikroskopi cihazları kullanın.
   1. 1 mL ddH₂O içinde ağır bir L. pneumophila yaması, 2–3 μL seyreltme girdabı ve pipeti pedlere çöz. Yapıştırıcı çerçevenin üzerine nazikçe 50 x 24 x 0.15^{mm 3} kaplama yapıştırıcıyı yerleştirin.
   2. Yakalama penceresinde ND'yi 180'e ayarlayın. Binning'i 2×2'ye ayarlayın ve 488 nm kanalını kullanarak örneği 500–1.000 ms arasında pozlayın. Floresans sinyalinin özgüllüğünü, aynı parametrelerle etiketlenmemiş L. pneumophila görüntülemesi ile doğrulayın (Şekil 3).

Sonuçlar

Şekil 1: L. pneumophila kromozomuna sfGFP eklemek için kullanılan homolog rekombinasyon ve allel değişiminin şematik genel bakışı.(A) Triparental çiftleşme, konjugatif plazmid pRK600'ü (bir IncP plazmidi) b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100x Plan Apo hedefi (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Aktif kömür	Sigma-Aldrich	C5510
Agarose GPG/LMP, düşük erime	Amerikan biyoanalitik	AB00981
Bacto dehidratlı agar	BD	214010
Gen Çerçevesi, 1.7x2.8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-Sistein	Sigma-Aldrich	C7352
Mikroskop kapak slaytları 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Mikroskop kapak slaytları 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Mikroskop slaytları 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Akıllı Görüntüleme Yenilikleri
Spectra X hafif motoru	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Maya Ekstraktı	BD	212750