Clostridium difficile enfeksiyonunun fare modeli oluşturulması

Özet

Kaynak: Winston, J. A. ve diğerleri. Klâlis olarak Önemli Clostridium difficile Strain R20291 için sefoperazonla tedavi edilmiş fare modeli. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, antibiyotikle önceden tedavi edilmiş farelerin Clostridium difficile sporlarıyla aşılanması prosedürünü göstererek patogenezi ve konak yanıtlarını incelemek için enfeksiyon modeli oluşturulmuştur.

Protokol

Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.

1. Clostridium difficile spor inokulumun hazırlanması ve farelerin oral gawage

NOT: C. difficile sporlarıyla zorlanan fareler, Biyogüvenlik Seviye 2 bir hayvan tesisinde barındırılmalıdır.

1. İstenilen suşun (bu durumda R20291) steril suda 4 °C sıcaklıkta hazırlanıp saklandığı C. difficile spor stoğunu elde edin. Bu spor stokunun kullanımdan önce sayımını belirleyin.
2. Spor stokunun bilinen konsantrasyonuna (sporlar/ml) dayanarak, istenen seyreltme hesaplanarak 25 μl'de 10⁵ spor elde edilir. Inokulum hacminin deneydeki tüm fareleri aşılamak için yeterli olduğundan emin olun (fare başına 25 μl), inokulumun sayımı (yaklaşık 30 μl) ve pipetleme hatasını hesaba katmak.
3. Vortex, orijinal C. difficile spor stoku. Daha sonra, orijinal C. difficile spor stokunun hesaplanan hacmini (1.2. adımdan itibaren) vidalı kapalı bir mikrosantrifüj tüpü içinde steril suya yeniden askıya alın. Bunu laminar akış başlıkta aerobik olarak yapın. Bu seyreltilmiş karışımı "spor aşısı" olarak tanımlayın.
4. Spor aşısını 65 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve 20 dakika ısıtın.
   NOT: Bu adım, ısı işlemden sonra sadece aktif C. difficile sporlarının kalmasını sağlar.
5. Laminar akış başlığı içinde, 50 μl ısıtılmış spor inokulum alın, steril bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir ve anaerobik odaya aktarılır. Bu örneği spor sayımı için kullanın.
6. Laminar akış başlığı içinde, kalan ısıtılmış spor inokulumunu steril ampullü uçlu mide gavaj iğnesine bağlı 1ml'lik bir enjektöre yükleyin. Fareler arasında doğru ve hızlı tekrar dozlama sağlamak için manuel bir şırınga adımı kullanın. Kullanmadan önce gavaj iğnesinin ısıtılan spor aşısı ile doldurulduğundan emin olun.
   NOT: Her fare için yeni steril bir gavage iğnesi gerekmez. Ancak, çeşitli dozlarda C. difficile sporları uygulanırsa, her doz için yeni bir gavaj iğnesi önerilir.
   NOT: C. difficile sporları geleneksel dezenfektanlara karşı oldukça dirençlidir. Bu nedenle, #62 Perisept Sporicidal Dezenfektan gibi sporisid dezenfektan kullanımı gereklidir. Üretici, C. difficile sporlarını yok etmek için 2 dakikalık temas süresi önerir.
7. Her fareyi 25 μl spor aşısı ile gavage edin. Her fareyi nazikçe tutarak hayvanın boynunun ve sırtının gevşek derisinden tutarak başını hareketsiz hale getirin. İşaret parmağı kullanılarak hayvanın başı daha da hareketsiz hale gelir ve yemek borusu uzatılır. Hayvanın kısıtlama sırasında ses çıkarmadığından veya başka bir sıkıntı belirtisi göstermediğinden emin olun.
   NOT: Farelere gavaj ile verilen toplam hacim vücut ağırlığı 10 ml/kg (0,1 ml/10 g) üzerinde olmamalıdır.
8. Fareyi dik ve dikey pozisyonda tutun ve gavage iğnesini nazikçe ağzın yanına geçirin. Gavaj iğnesini ağız tavanında yönlendirin ve gavaj iğnesini yavaşça yemek borusuna doğru ilerletin.
   NOT: Herhangi bir dirençle karşılaşılırsa, gavaj iğnesi trakeaya giriyor olabilir ve bu nedenle ileri sürülmemeli, hemen çıkarılıp yeniden konumlandırılmalıdır.
9. Gavaj iğnesi yemek borusunun yaklaşık yarısına kadar geldikten sonra, ısıtılan spor inokulumundan 25 μl enjekte edin ve gavaj iğnesini özofagustan nazikçe çekin.
   NOT: Gavage iğnesinin zorla ilerlemesi yemek borusunun veya midenin yırtılmasına yol açabilir. Bu nedenle, gavaj iğnesi ilerletilirken dirençle karşılaşılırsa, gavaj iğnesini hemen çıkarıp yeniden konumlandırmak en iyisidir.
10. Hayvanı kafesine geri götürün ve herhangi bir öksürük veya solunum sıkıntısı belirtisi olup olmadığını gözlemleyin; çünkü bu, trakeal trakeal kullanımı veya ısıtılmış spor aşısının aspirasyonuna işaret edebilir.
    NOT: Fareler, antibiyotik tedavisinden sonra C. difficile'a karşı son derece hassastır; Bu nedenle, kafesler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için önlemler almak gereklidir. Bu özellikle antibiyotikle tedavi edilen ancak zorlanmayan fareleri kontrol olarak yönetirken önemlidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
#62 Perisept Sporidicial Dezenfektan Temizleyici	SSS Navigator	48027	Bu ürün, üreticinin önerdiği gibi seyreltilmesi gerekecektir
C57BL/6J Fare	Jackson Laboratuvarı	664	Fareler 5 - 8 haftalık olmalı
2 ml Mikro Santrifüj Vida Kapağı	Corning	430917