$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından incelenmiştir.
- Clostridium difficile (C. difficile) Sayımına Örnekler Almak
NOT: Dışkı veya çekal içeriği elde etmeden önce, steril mikrosantrifüj tüplerini analitik bir tartıda tartın. Tüpün yan tarafında tüp ağırlığını dört ondalık basacama yuvarlayarak kaydedin (örneğin, 0.9864 g). Bu ağırlığı "tüp ağırlığı" olarak belirtin. Toplanan her örnek, steril, tartılmış bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmelidir.
1. Fare dışkısının steril toplanması- Her fareyi nazikçe tutarak hayvanın boynunun ve sırtının gevşek derisinden tutup başını hareketsiz hale getirin. Küçük parmağı kullanarak hayvanın kuyruğunu nazikçe tutarak anüsü açığa çıkar. Hayvanın kısıtlama sırasında ses çıkarmadığından veya başka bir sıkıntı belirtisi göstermediğinden emin olun.
- Steril, tartılmış bir mikrosantrifüj tüpünü hayvanın anüsünün hemen altına tutun. Tüpün fareyle doğrudan temas etmemesi şarttır.
- Hayvan dışkılanırken, dışkı pelletini tüpten içine toplayın. Tüm dışkı örnekleri toplanana kadar tüpü oda sıcaklığında tutun. Bir farenin dışkı yapması birkaç dakika sürebilir, bu yüzden dışkı toplamak için tekrar tekrar denemeler yapılması gerekir.
- Dışkı içeren tüpleri analitik tartıda tartın. Tüp ağırlığını dört ondalık basamaya yuvarlayarak kaydedin (örneğin, 1.0021 g). Elde edilen ağırlığı "son boru ağırlığı" olarak belirtin.
- Dışkı toplandıktan hemen sonra dışkı örneklerini bakteri sayımı için anaerobik odaya verin.
- C. difficile'nin Bakteriyel Sayımı
- C. difficile için sayılacak içeriklerin (dışkıların) nihai ağırlığını hesaplayın. Bunu, "son tüp ağırlığı"nı "tüp ağırlığından" çıkararak gerçekleştirdim.
- İçeriğin 1:10 oranında 1X fosfatla tamponlanmış tuzlu süzme (PBS) olarak hesaplanıp buna göre tekrar süzültülmesini yapın. Dışkı pelletleri için, pipetin ucunu kullanarak pelleti nazikçe çözeltiye dönüştürün.
- Bu yeniden askılanan örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca anaerobik olarak kuluçka yapın, böylece içeriğin çökmesine izin verin.
- Her örnek için 1x PBS ile seri seyreltmeler yapın; bu da koloni oluşturan birimlerin (CFU) g içeriği (dışkı) başına sayılması için. Bunu anaerobik olarak yapın.
- Aseptik teknikle, her seri seyreltmeden 100 μl taurocholate cycloserine cefoxitin fruktoz agar (TCCFA) plakalarına aktarılır. Steril L şeklinde bir yayıcı kullanarak, uygulanan seyreltiyi malzemeye yayarak plaka boyunca eşit şekilde yayın. Seyreltme yayılması bile koloni sayımlarının doğru olarak belirlenmesi için gereklidir.
- Plakaları 24 saat boyunca 37 °C'de anaerobik olarak kuluçka yapın. Bu aşamada, C. difficile kolonilerini sayarak CFU'yu (dışkı) için g. C. difficile kolonileri düz ve soluk sarıdır, kenarları düzensiz ve cam gibi bir görünüme sahiptir.
NOT: Bu protokol, ileal ve kolon içeriği dahil olmak üzere diğer fare gastrointestinal (GI) içeriklerinden C. difficile'i saymak için kullanılabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakaları seri seyreltme yapmak için kullanılabilir.