Makrofaj Reseptörü Etkileşimlerinin Bakteriyel Antijenlerle Araştırılması için Flüoresans Tabanlı Analiz

Özet

Kaynak: Barbero, A. M. , et.al. Mycobacterium tuberculosis ile bağışıklık reseptörü SLAMF1 ile etkileşiminin incelenmesi için floresans testleri. J. Vis. Exp. ( (2025)

Bu video, makrofaj reseptörü ile Mycobacterium tuberculosis antijenleri arasındaki etkileşimi incelemek için floresans tabanlı bir test sunmaktadır. Örtü üzerinde floresan olarak işaretlenmiş antijenler, makrofaj protein özetleriyle kuluçkalanır, çapraz bağlanır, antikor etiketlenir ve üst üste düşen floresan sinyalleriyle görselleştirilir.

Protokol

1. Mycobacterium tuberculosis -SLAMF1 etkileşimi floresans mikroskopisiyle

1. Bakteri-protein çapraz bağlanması
   1. 12 mm yuvarlak örtü sliplerini 24 kuyruklu kültür plakalarına (her kuyu başına 1 coverslip) yuvarlak burunlu cerrahi cımbız kullanarak yerleştirin.
      NOT: Kapak kapaklarını %70 etanol ile iyice temizleyin. Istenirse, 30 dakika boyunca UV ışığı altında otoklavlanabilir veya sterilize edilebilirler.
   2. Kaplamayı 4 °C'de gece boyunca 400 μL 10 μg/mL Poly-D-Lizin ile kuluçka yapın. Plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın.
   3. Ertesi gün, tabağı buzdolabından çıkarın ve kapak kapakını 1 ml suyla iki kez yıkayın.
   4. Örtü kurusun.
   5. 20 μL (2 x 10⁶) Mtb-R Ags'i 180 μL 1x PBS ile seyreltin. Son 200 μL ise bir coverslip'i tamamen kapatmak için yeterli.
   6. Örtü kuşağını Mtb-R Ags ile 37 °C sıcaklıkta 1 saat boyunca bir hücre kuluçka makinesinde inkubasyon yapın.
   7. Kalan sıvıyı atın ve 1mL 1x PBS (Fosfatla tamponlanmış salin) ile iki kez yıkayın.
      NOT: Bu adımda, Mtb-R'nin örtü kayışına doğru yapışması, kırmızı kanala karşılık gelen filtreler kullanılarak floresans mikroskobu ile kontrol edilebilir.
   8. 400 μL bloklayıcı tampon (%10 fetal sığır serumu (FBS)) 1x Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) 30 dakika RT'de çalkalayıcı (shaker) ile ekle.
   9. 400 μL bloklayıcı tampon ile iki kez yıkayın.
   10. 100 μL protein ekstraktı ile 300 μL 1x PBS ile sulandırılmış olarak RT (shaker) içinde 2 saat boyunca inkübe yapın.
   11. 1x PBS ile seyreltilmiş 400 μL %1 formaldehit ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca çalkalama (çalkalayıcı) altında kuluçka yapın.
   12. 500 μL 0,125 M glisin suya karıştırın. RT'de 5 dakika boyunca kışkırtma (shaker) altında kuluçka yapın.
   13. 1 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın.
   14. 400 μL 2 mM Etilen glikol bis(sukcinidilsuccinate) (EGS) ekle (EGS) RT'de 1 saat boyunca çalkalayıcıda (shaker).
   15. Adım 1.1.13'ü tekrarlayın
       NOT: Reaktiflerin kullanım anında hazırlanması şiddetle tavsiye edilir.
2. SLAMF1 boyama
   1. Kültür tabağının kapağını parafin filmiyle sarın.
   2. Parafin filmi kaplı kapağa daha önce titrlenmiş anti-SLAMF1 birincil antikoru (1:75 seyreltme) 60 μL damlatma ekleyin.
   3. Örtü slip'i dikkatlice levhadan eğimli ince uçlu cerrahi cımbız ve iğnelerle çıkarın.
      NOT: Örtü kaydırmasının kaldırılmasını kolaylaştırmak için iğne yaklaşık 45° açıyla bükülebilir.
   4. Antikoru içeren damla üzerine coverslip'i ters çevirin. Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
   5. Kapak kayışını kaldırın ve bloklama tamponu ile iki kez yıkayın.
   6. Coverslip'i, ikincil antikoru içeren yeni bir damla üzerinde ters çevirin (1:200 seyreltme). Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
   7. 1.2.5 adımını tekrarlayın.
   8. Fazla sıvıyı çıkarın ve kapak parçasını cam bir sürgüye yerleştirilmiş montaj sıvısının üzerine monte edin.
   9. Yeterli filtrelerle floresans mikroskobu altında gözlemleyin.
      NOT: Steril koşullarda çalışmak tavsiye edilir. Bloklayıcı tampondaki antikorları seyreltirin. Mikroskop altında gözlemi engelleyebilecek çiziklerden kaçınmak için örtü slip'i dikkatlice kullanın. Floresans için uygun bir montaj sıvısı şiddetle tavsiye edilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 488 ikincil antikor	Invitrogen	A21121	Flüoresans mikroskopisi için
Anti-SLAMF1 birincil antikor	BioLegend	306302	Flüoresans mikroskopisi için
Aqua-Poly/Mount	Çok bilimler	18606-20	Montaj medyası
Kapak kaydırmaları 12mm	HDA	-	Mikroskopi ile etkileşim testi için
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Çapraz bağlama tedavisi için
Formaldehit	Merck	K47740803613	Çapraz bağlama tedavisi için
Cam kaydıraklar	Cam Klass	-	Mikroskopi ile etkileşim testi için
Glisin	Sigma	G8898	Çapraz bağlama tedavisi için
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Colibri 7 aydınlatma modülü ile floresans mikroskobu
Poli-D-Lisin	Sigma Aldrich	A-003-M	Coverslip tedavisi için
Rhodamine B	Sigma Aldrich	21955	M için. Tüberküloz boyama