Mikrogavaj kullanarak Zebrafish larva enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi

Özet

Kaynak: Li, J. ve diğerleri. Clostridioides difficile için larva zebrafish enfeksiyonu modelinin geliştirilmesi. J. Vis. Exp. (2020).

Bu video, anestezi edilmiş zebrafish larvasının agarozda immobilize edilip izleyici yönlendirmeli iğne kullanılarak patojenik bir bakteriyle oral enjekte edildiği mikrogavaj prosedürünü gösteriyor. İnvaziv olmayan teslimat, doğal enfeksiyonu taklit eder ve bakteriyel çoğalması, toksin salınımı ve bağırsak epitel hasarının analizini mümkün kılar.

Protokol

1. Zebrafish Larvalarının Gavajı

1. Mikrogavaj iğnesini kalibre edin.
2. İğnenin ucunun çapını, bir damla mineral yağ ile kalibrasyon slaytına koyarak ölçün. Ucunun çapı 30–40 μm olduğundan, küt ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Keskin veya pürüzlü iğneleri atın.
   NOT: İğnelerin keskin kenarları hızlı alevlenmekle körletilebilir.
3. Gavaj çözeltisini hazırlayın.
4. İğneyi mikro manipülatörü yükleyip monte edin.
5. Mikromanipülatörü iğneyi 45° açıyla konumlandıracak şekilde ayarlayın.
6. Zebrafish larvalarını anestezi edin. Larvalar hareket etmeyi bıraktığında, onları Pasteur pipeti kullanarak mikrogavaj kalıbının yuvasına aktarın.
7. Zebrafish larvalarının üzerine %0,8 düşük eriyen agaroz damlası koyarak üzerini kapatın. Larvaları başları olukta 45° açı açısında dik olacak şekilde nazikçe ayarlayın ve kuyrukları oluk duvarına yaslansın. Başların açılarının yaklaşık aynı olduğundan emin olun, böylece gavaj iğnelerinin açısıyla hizalansınlar. Mikrogavaj kalıpı 30–60 saniye buzun üzerine yerleştirin; düşük eriyen agarozun katılaşmasını sağlayarak larvaların konumlarını stabilize edin.
8. Enjeksiyon basıncını 200–300 hPa arasında ayarlayın. Enjeksiyon süresini 0,1–0,3 saniye olarak ayarlayarak 3–5 nL Clostridioides difficile enjeksiyon hacmi elde edin.
9. İğneyi nazikçe agarose içinden geçirin, ardından zebrafish larvalarının ağzına, yemek borusu üzerinden geçirin. İğnenin ucu ön bağırsak ampulünün içine girdiğinde, enjeksiyon pedalına basarak bakterileri serbest bırakın. Bağırsak lümenini verilen hacmle doldurun. Yemek borusundan veya kloakadan taşmasına izin vermeyin. İğneyi zebra balığının ağzından nazikçe çekin.
10. Gavaj işleminin ardından, enfekte zebrafish larvalarını agarose'dan esnek bir mikroloader ucu ile önce agarozu keserek sonra larvaları kaldırarak kurtarın. Bu larvaları steril %30 Danieau'nun ortamına aktarın. Larvaları steril ortamda iki kez durulayın. Larvaları taze 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Larvalar, döllenme sonrası (dpf) en fazla 11 güne kadar korunur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra düşük jelleşen agaroz
Agaroz düşük erime (LM)	Pronadisa	8050	Agararoz plakalarında kullanılır
Kapiler Cam	Harvard Aparatı	30-0019	Enjeksiyon iğneleri
Clostridioides difficile			R20291,, bir ribotip 027 suşu, TcdA+/TcdB+/CDT+ üretimi
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Açık kaynak platformu		Görüntü işleme
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Yatay iğne çekici	Sutter instrument Inc	P-87
L-sistein	Sigma-Aldrich	168149
Leica Uygulama Paketi X (LAS X)	Leica		Görüntü işleme
Mikro enjektör	Eppendorf	5253000017
Mikroenjeksiyon kalıpları	Uyarlanabilir Bilim Araçları	TU1
Leica SP8 konfokal mikroskobu	Leica
Fenol Kırmızı	Sigma-Aldrich	P0290
Potasyum klorür (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodyum klorür (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Trikain	Sigma-Aldrich	E10521
Maya ekstraktı	BD Bacto	212750