Arabidopsis yapraklarına vakum infiltrasyonu yoluyla bakteriyel bir patojenin aşılanması

Bu makalede

Özet

Kaynak: Rufián, J. S., et.al. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022)

Bu video, Arabidopsis bitki yapraklarına bakteriyel bir patojenin girmesi için vakum sızma yöntemini gösteriyor. Yaklaşım, stoma yoluyla uniform girişi sağlamak için hazırlanmış bakteriyel süspansiyon ve vakum darbeleri kullanır ve kontrollü yaprak enfeksiyonuna yol açar.

Protokol

1. Arabidopsis bitkilerinin aşılanması

NOT: Bu çalışmada, Pseudomonas syringae pv. domates DC3000 ve P. syringae pv. phaseolicola 1448A kullanıldı.

P. şırıngae aşısını hazırlayın.
1. İlgilendiğiniz P. syringae suşunu −80 °C gliserol stokundan LB plakasına (10 g/L tripton, 5 g/L NaCl, 5 g/L maya ekstraktı ve 16 g/L bakteriyolojik agar) uygun antibiyotiklerle takviye edilmiş şekilde izleyin. 28 °C'de 40-48 saat kuluçka yapın.
  NOT: İlgilenen suş plazmid veya genomik direnç geni taşıyorsa antibiyotik kullanımı önerilir. P. syringae için önerilen antibiyotik konsantrasyonları şunlardır: kanamisin (15 μg/mL), gentamisin (10 μg/mL), ampisilin (300 μg/mL).
2. Bakteriyel biyokütleyi kazıyıp 5 mL 10 mM_{MgCl 2} ile yeniden süzülür. OD_600'ü ölçün ve 10 mM MgCl₂ ekleyerek 0.1'e ayarlayın.
  NOT: P. syringae kültürünün 0.1 OD_600'ü 5 x 10⁷CFU·mL^−1'e karşılık gelir.
3. 10 mM MgCl₂ içine seri seyreltme uygulayarak 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹ nihai aşı konsantrasyonuna ulaşın. Arabidopsis bitkileri için 200 ml inokulum hazırlayın.
4. Aşılamadan hemen önce, Arabidopsis için %0,01 konsantrasyona yüzeyaktif Silwett L-77 ekleyin. Silwett'in Arabidopsis dokusuna biraz zararlı olduğunu unutmayın.
Vakum sızması gerçekleştirin.
1. Arabidopsis sızması için, iki ahşap çubuk bir X şeklinde saksının üzerine yerleştirilin (Şekil 1E) ve saksı aşağıya bakacak şekilde 200 mL aşı içeren 14 cm çapında Petri kapının üzerine yerleştirilin (Şekil 1F).
2. Aşı çözeltisine batırılmış bitkileri vakum odasına (Şekil 1G) yerleştirin ve yapraklara sızması için 30 saniye boyunca 500 mbar darbe verin. Vakum darbesini yaprak tamamen sızana kadar 2-3 kez tekrarlayın (Şekil 1H).
3. Fazla inokulum çözeltisini bir kağıtla boşaltın ve bitkileri ilgili büyüme odalarına geri döndürün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Arabidopsis bitkileri kullanılarak bakteriyel aşılama ve apoplast ekstraksiyonu. (A) Saksının metal ağ ile düzgün şekilde hazırlanması. (B) Tohumları, (C)'de belirtildiği ş...