Konak epitel hücrelerinde hücre içi Brucella abortus enfeksiyonunun yüksek verimli görüntülemesi

Özet

Kaynak: Casanova, A. ve diğerleri. Hela hücrelerinin brücella enfeksiyonunda rol alan konak faktörlerinin yüksek verimli taraması için mikroskopi tabanlı testler. J. Vis. Exp. (2016)

Bu video, siRNA aracılı STING knockdown ile epitel hücrelerinde Brucella abortus enfeksiyonunun yüksek verimli görüntülemesini göstererek sitozolik DNA algılamanın hücre içi bakteriyel çoğaltma ve konak doğuştan bağışıklık yanıtı üzerindeki rolünü araştırıyor.

Protokol

1. Enfeksiyon ve Takıntı

1. Enfeksiyondan bir gün önce, belirlenen miktarda B. abortus başlangıç kültürünü 50 ml TSB/Km (50 μg/ml kanamisin içeren Triptik Soya Suyru) ortamında 250 ml vida kapağı bir şişede aşılayın. Şişeyi Parafilm ile kapatın ve bakterileri gece boyunca 37 °C ve 100 rpm'de orbital sallayıcıda OD₆₀₀ = 0.8-1.1 seviyesinde büyütün.
2. Bakteriyel kültürün_{OD 600'ünü} ölçer ve enfeksiyon ortamını DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) /%10 FCS (Fetal buzağı serumu) içinde seyreltirerek istenen enfeksiyon çokluğunu (MOI) elde edersiniz.
   NOT: HeLa hücrelerinde %5-10 enfeksiyon oranı elde etmek için 10.000 MOI kullanılır. Optimal enfeksiyon oranları elde edilebilmek için her hücre tipi için bir MOI titrasyon eğrisi yapılmalıdır.
3. 384 kuyu plakasının transfeksiyon ortamını, otomatik plaka yıkama makinesi kullanılarak 50 μl enfeksiyon ortamı ile değiştirin.
4. 384 kuyu plakasını 400 x g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.
   NOT: Bu, enfeksiyon sürecinin senkronize edilmesine yardımcı olur.
5. Plakayı Parafilm ile mühürleyin ve 37 °C nemli bir kuluçka makinesinde %5_CO2 ile önceden ısıtılmış alüminyum bir plakada 4 saat kuluçka yapın.
6. Hücreleri, otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak (200 μl/kuyu taşma yıkama kullanın) hücre dışı bakterileri inaktive etmek için 100 μg/ml Gm (gentamisin) içeren DMEM/%10 FCS ile yıkayın.
   NOT: Taşma yıkama sırasında, otomatik plaka çamaşır makinesi aynı anda hem dağıtır hem de aspirasyon yapar.
7. Giriş testi için, hücreleri DMEM/%10 FCS ile 100 μg/ml Gm ve 100 ng/ml aTc içeren otomatik plaka yıkama makinesi ile ikinci kez yıkayın (200 μl/kuyu taşma yıkama kullanın).
8. Plakayı Parafilm ile kapatın ve %5_CO2 ile 37 °C nemli kuluçka makinesinde önceden ısıtılmış alüminyum plakaya geri getirin; bu işlem sırasıyla son nokta testi ve giriş testi için 40 saat veya 4 saat daha uygulanır.
9. Fiksasyon için, kuyuları PBS (fosfatla tamponlu tuzlu suyum) ile otomatik plaka yıkayıcı ile yıkayın (200 μl/kuyu taşma yıkaması kullanın).
10. PBS'yi, otomatik plaka yıkama makinesi kullanılarak pH 7.4 olan 0.2 M HEPES'te 50 μl %3.7 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin.
    NOT: Dikkat: PFA solulma, cilt teması ve yutulması yoluyla toksiktir.
11. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
12. Fiksasyon ortamını, otomatik plaka yıkama makinesi kullanarak 50 μl PBS ile değiştirin.
    NOT: Örnekler artık gerekirse BSL3'ten çıkarılmaya hazır.
    DIKKAT: BSL3 (Biyogüvenlik Seviye 3) tesisinden herhangi bir örneğin alınması, risk değerlendirmesi ve prosedürün onaylanmasına tabidir ve biyolojik güvenlik için geçerli düzenlemelere bağlıdır.

2. Boyama

1. Hücreleri 50 μl PBS ile iki kez yıkayın.
2. Hücreleri 50 μl 0,1% Triton-X-100 içinde PBS içinde 10 dakika boyunca permeabilize edin.
3. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) içeren 20 μl PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
4. Hücreleri PBS'de üç kez yıkayın ve lekeleri alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Triptik Soya Suyu (TSB)	Fluka	22092
Kanamisin sülfat	Sigma-Aldrich	60615
250 ml vida kapaklı şişe	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Baldır Serumu (FCS)	Gibco	10270	Isı ile inaktif hale getirilen
Greiner CELLSTAR 384-kuyu plakası	Sigma-Aldrich	M2062
Soyulabilir alüminyum folyo	Yardımcı Oyuncu	6570
Reaktif dağıtıcısı: "Multidrop 384 Reaktif Dağıtıcısı"	Termo Bilimsel	5840150	Alternatif bir reaktif dağıtıcı kullanılabilir.
Transfeksiyon reaktifi: "Lipofektamin RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Otomatik plaka yıkalayıcı: "Plaka yıkayıcı ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Bu plaka alçalma makinesi, 384 kuyu plakaları için uygun 16 kanallı bir manifold içerir. Biyogüvenlik dolabına oturur ve yıkama sırasında plakayı kaplayan bir kapak bulunur, bu da aerosol üretimi riskini azaltır. Benzer özelliklere sahip alternatif plaka yıkayıcılar kullanılabilir.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148	0,2 M HEPES tamponunda çözünür, pH 7,4. -20 °C'de saklayın ve kullanımdan bir gün önce taze çözülün. Dikkat, PFA soluma yoluyla, ciltle temas yoluyla ve yutulduğunda toksiktir.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Moleküler Cihazlar	IXM GÖRÜNTÜLEME MSCOPE	Hassas motorlu Z-aşama ile donatılmış otomatik hücresel görüntüleme mikroskobu. Aşağıda belirtilen otomatik mikroskopi için alternatif sistemler ve sabit ve yazılım için alternatif bileşenler kullanılabilir.