$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. D2O Antibiyotik varlığında dahil edilen tedavi (Şekil 1a)
- Bakteri konsantrasyonunu, 600 nm dalga boyunda bir fotometre ile optik yoğunluğu (OD) ölçerek kontrol edin.
- Bakteriyel çözeltiyi normal Mueller-Hinton suyu (MHB) ortamı kullanılarak seyreltirin; bu ortam süsü içermeyen ve nihai hücre konsantrasyonu 8 x 105 CFU/mL elde edilir. Bakteri hücrelerini karıştırmak için nazikçe vortex yapın.
- Yedi adet 1,5 mL mikro tüpte bakteriyel çözeltinin 300 μL alikotu, bir 1,5 mL'lik mikro tüpte ise 600 μL aliquot bakteriyel çözeltiyi hazırlanın.
- Mikro tüpte 600 μL bakteriyel çözelti içeren 4,8 μL antibiyotik (gentamisin veya amoksisilin) stok çözeltisi (1 mg/mL) ekleyerek nihai antibiyotik konsantrasyonu 8 μg/mL'ye ulaşır.
- Antibiyotik içeren bakteri çözeltisinin 8 μg/mL'sinden 300 μL çözelti alın ve başka 300 μL bakteriyel çözeltiye ekleyerek bakteri içeren iki kat seyreltilmiş antibiyotik (4 μg/mL) çözeltisi oluşturulur.
- Test antibiyotiklerinin, gentamisin veya amoksisilinin iki kat seri seyreltmesini tekrarlayın, en düşük konsantrasyona (0,25 μg/mL) sahip mikro tüpe ulaşana kadar ve tüpten 300 μL çıkarılın. Hem gentamisin hem de amoksisilin için seri konsantrasyonlar 0,25 μg/mL ile 8 μg/mL arasında değişir.
- Boş kontrol için bir tüpü antibiyotiksiz bırakın. Bu, antibiyotik tedavi olmadan ama D2O tedavisiyle bakteri metabolik aktivitesini kontrol etmek için pozitif kontrol olacaktır.
- Negatif kontrol için antibiyotik olmayan bir tüpü ve D2Oolmadan bırakın.
- Bakteriyel alikotu MHB ortamı içeren belirli bir antibiyotikle (gentamisin veya amoksisilin) 1 saat kuluçka edin.
- Kuluçka sırasında, %1.6 ile aynı konsantrasyon gradyanına sahip antibiyotiklerin %100 D2O içeren ortamı seri sulandırıcı hazırlanır. Hem gentamisin hem de amoksisilin için seri konsantrasyonlar 0,25 μg/mL ile 8 μg/mL arasında değişir.
- 1 saat antibiyotik tedavisinden sonra, aynı antibiyotikle önceden aranmış bakterilerin 300 μL'sine (adım 1.6'da hazırlanmış) seri seyreltilmiş antibiyotik ve %100μLMHB ortamı eklenin.
- Örneğin, 8 μg/mL antibiyotikle aranmış bakterinin 300 μL'sine %100 μL D2O içeren MHB ortamı (8 μg/mL antibiyotik içeren) 700 μL ekleyin. Aynı şekilde, bir sonraki konsantrasyona sahip ilgili tüplere aktarın ve birkaç kez yukarı aşağı pipetle homojenleştirin.
- 700 μL antibiyotiksiz %100 D2O içeren MHB ortamını, 300 μL antibiyotiksiz bakteriye (1.6.1 adımında hazırlanmış) ekleyerek boş kontrol olarak kullanılır.
- 37 °C'de 200 rpm'de kuluçka çalkalayıcısında ek 30 dakika kuluçka yapın.
NOT: Bu adımda, test için ortamda D2O nihai konsantrasyonu %70'tir.
- İlk olarak, 1 mL antibiyotik ve D2O ile işlenmiş bakteri örneği 6200 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edilir, ardından iki kez arıtılmış suyla yıkanır. Son olarak, örnekleri %10 formalin çözeltisine sabitleyin ve 4 °C'de saklayın.
2. tek bir bakteride D2O metabolik inkorporasyonunun uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi
- 1 ml sabit bakteri çözeltisini arıtılmış suyla yıkayın ve ardından 6200 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst yüzeyi çıkarın. Bakteriyel çözeltiyi yaklaşık 20 μL olarak zenginleştirin.
- Bakteriyel çözeltiyi poli-L-lizin kaplı bir örtü camına bırakın. Numuneyi SRS görüntülemesi için sandviç ve mühürle.
- Bakterileri SRS mikroskobu kullanarak 2168 cm-1 titreşim frekansında C-D titreşim frekansında görüntüleyin.
- Bilgisayardaki kontrol yazılımını kullanarak pompa dalga boyununu 852 nm'ye girin ve ayarlayın.
- Lazer gücünü bir güç ölçer kullanarak ölçün. Pompa lazerinin örnekteki gücünü ~8 mW, Stokes lazerinin numunedeki gücünü ise ~40 mW olarak ayarlayın; lazer çıkışının önündeki yarım dalga plakasını ayarlayın.
NOT: SRS mikroskobunda, 80 MHz tekrar hızına sahip ayarlanabilir femtosaniye lazeri pompa (680 ila 1300 nm) ve Stokes (1045 nm) uyarılma lazerleri sağlar.
- Yansıtma aynalarının vidalarını ayarlayarak, pompa ve Stokes ışınlarını mekansal hizalamakta ve iki ışını lazer taraması için 2D galvo ayna sistemiyle donatılmış dik bir mikroskopa yönlendirir.
- Pompayı ve Stokes lazerlerini örnek üzerine odaklamak için 60x suya daldırma objektif kullanın.
- Numuneden sinyalleri ileri yönde toplamak için yağ kondansatörü kullanın.
- Stokes lazerini filtrelemek için bant geçirimli filtre kullanın, sonra onu fotodiyota yönlendirin.
- Uyarılmış Raman sinyalini bir kilitli amplifikatör ile çıkarın ve sinyalleri bir fotodiyot ile tespit edin.
- Her SRS görüntüsünü 200 x 200 piksel ve yazılımın kontrol panelinde 30 μs piksel bekleme süresi olarak ayarlayın. Bir görüntünün toplam alım süresi ~1.2 saniyedir. Step boyutunu 150 nm olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30μm² olur. Her örnek için en az üç görüş alanı görüntüleyin.