Patojen Enfekte Drosophila Hemositlerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Hiroyasu, A. ve diğerleri. Drosophila melanogaster larvalarından hemositlerin mikrobiyal enfeksiyon ve analiz için ekstraksiyonu. J. Vis. Exp. (2018)

Bu video, Coxiella burnetii ile enfekte olmuş Drosophila melanogaster hemositlerinin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesini sunarak patojenin lokalizasyonunu 3D olarak görselleştirerek hücre içi enfeksiyon dinamikleri ve konak-patojenler etkileşimlerinin ayrıntılı analizini mümkün kılmaktadır.

Protokol

1. Konfokal görüntüleme
   1. DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol), EGFP (gelişmiş yeşil floresan protein) ve mCherry'nin üç renkli görüntülemesi için konfokal mikroskobu yapılandırın. Aşağıdaki ayarı kullanın: DAPI uyarılma (örneğin) 405 nm, emisyon (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Örneği mikroskopa yerleştirin ve 63X/1.4 sayısal açıklık (NA) objektif kullanarak numuneye odaklanın. İstediğiniz hemositleri görüntüleme için görüş alanında konumlandırın.
   3. Örnekin uygun şekilde poz almasını sağlamak için lazer gücünü ve dedektör kazançlarını ayarlayın. Tüm örnek kalınlığına uygun pozlama seviyesinin olduğundan emin olmak için birden fazla z-düzlemini kontrol edin.
   4. Tüm hemositin z-ekseninde üst ve alt pozisyonları bulun. Bu pozisyonları z-bölümleme için başlangıç ve bitiş pozisyonları olarak ayarlayın.
   5. Hemositin bulunduğu alanı görüntülemek için sadece taramalı zoom kullanın. 3X zoom faktörleri genellikle kullanılır.
   6. Görüntü serisi, x-y düzleminde 1024 x 1024 piksel ve z boyutunda 0.3 μm aralık gibi uygun çözünürlükte toplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Coxiella burnetii - mKiraz	Dr. Heinzen, R.
Mikroskop kaplama camı	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-fenilindol	Thermo Fisher Scientific	62247
Konfokal mikrosop	Leica	TCS SP8-X Beyaz Işık Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu
Mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-552-3